Vengeance de phages: analyses structurales et fonctionnelles de protéines anti CRISPR-Cas9 – PHARE

Nos protéines d’intérêt sont produites chez Escherichia coli, purifiées et caractérisées par des méthodes biochimiques et biophysiques (diffusion de la lumière, test de coupure d’ADN in vitro, analyses d’interaction macromoléculaires). La caractérisation structurale est réalisée par cristallographie aux rayons X et cryo-microscopie électronique. Les nanobodies sont générés par la plateforme NabGen Technology (https://nabgen.org/technologie/nanobodies/). Les tests fonctionnels des protéines anti-CRISPR en contexte cellulaire sont réalisés par nos collaborateurs Sylvain Moineau et Yannick Doyon (Université Laval Québec).

Nos travaux nous ont permis de décrire un mécanisme inédit d’inhibition allostérique de CRISPR-Cas9 par la protéine anti-CRISPR AcrIIA6. AcrIIA6 interagit avec une région de St1Cas9 distincte des sites de liaison de l’ADN cible et des domaines nucléases. Ce faisant, AcrIIA6 modifie la structure et la dynamique de St1Cas9, empêchant ainsi la reconnaissance de l’ADN à détruire. En outre, AcrIIA6 a la capacité de séquestrer deux molécules de St1Cas9 à la fois, ce qui en fait une protéine anti-CRISPR particulièrement efficace pour affaiblir sa proie et assurer la réplication rapide d’une population de phages. Par ailleurs, la caractérisation de ce mécanisme d’inhibition a permis d’identifier un variant naturel de CRISPR-Cas9 résistant à cet inhibiteur. Ce variant, portant des modifications au niveau de site de liaison d’AcrIIA6, illustre la pression de sélection exercée par les protéines anti-CRISPR sur l’évolution et la diversification moléculaire des systèmes CRISPR-Cas9, et représente l’un des premiers exemples de mécanismes anti-anti-CRISPR, qui restent peu documentés à ce jour.

Notre projet d’analyses structurales et fonctionnelles de protéines anti-CRISPR-Cas9 illustre la diversité des mécanismes d’action de ces inhibiteurs de l’immunité bactérienne CRISPR-Cas9. Nos travaux en cours sur la protéine anti-CRISPR AcrIIA5 montrent que cet inhibiteur possède une activité enzymatique nucléase qui affecte l’activité de différents systèmes CRISPR-Cas9. Il s’agirait du premier exemple d’une protéine anti-CRISPR-Cas9 avec une activité enzymatique.

1. Fuchsbauer, O., Swuec, P., Zimberger, C., Amigues, B., Levesque, S., Agudelo, D., […], Goulet A. (2019). Cas9 Allosteric Inhibition by the Anti-CRISPR Protein AcrIIA6. Mol. Cell 76, 922-937.e7.
hal-03050625

2. Agudelo D, Carter S, Velimirovic M, Duringer A, Levesque S, Rivest JF, Loehr J, Mouchiroud M, Cyr D, Waters PJ, Laplante M, Goulet A, and Doyon Y. (2020) Versatile and robust genome editing with Streptococcus thermophilus CRISPR1-Cas9, Genome Res., 30(1):107-117
hal-03050601

3. Hardouin, P., Goulet, A. (2020). Diversity of molecular mechanisms used by anti-CRISPR proteins: the tip of an iceberg?, Biochemical Society Transactions, 48(2):507-516
hal-03049948

Les virus infectant les bactéries (bactériophages ou phages) sont les entités biologiques les plus abondantes et les plus diversifiées sur Terre. Pour prospérer dans des écosystèmes dominés par les phages, les bactéries ont dû développer des stratégies de défense multiples et sophistiquées, dont le fameux système CRISPR-Cas9. Naturellement les phages ont mis en place plusieurs tactiques leur permettant d’y échapper, dont des protéines anti-CRISPR (Acrs), donnant ainsi lieu à la perpétuelle course aux armements entre les phages et leurs hôtes. Alors que les premières Acrs ont été découvertes chez des prophages (phages intégrés dans le génome de leur hôte) leur permettant essentiellement de se protéger contre une attaque auto-immune, on a longtemps douté de leur existence chez les phages strictement lytiques (virulents). Ce n’est que très récemment que notre collaborateur a identifié deux familles d’Acrs permettant à des phages virulents de contourner la réponse immunitaire CRISPR-Cas9 de Streptococcus thermophilus. L’étonnante diversité de séquences des Acrs connues à ce jour, leur présence quasi-ubiquitaire chez les phages, et l’absence d’homologues de fonction connue ajoutent un volet fascinant à l’histoire CRISPR-Cas. Ces caractéristiques soulèvent de nombreuses interrogations concernant notamment leur mécanisme moléculaire et leur rôle potentiel dans la biologie des phages au-delà de l’inhibition de CRISPR-Cas9. Par ailleurs, les Acrs constituent le premier exemple de molécules permettant d’inactiver CRISPR-Cas9 dans le cadre des techniques de modification de gènes ; elles offrent ainsi des perspectives prometteuses quant à leur utilisation comme outils de régulation de CRISPR-Cas9 en recherche biomédicale et thérapie génique. Tout reste à faire dans ce jeune mais néanmoins dynamique domaine de recherche ; avec PHARE nous proposons un projet innovant qui s’articule autour de trois objectifs. Premièrement, élucider le mode d’action au niveau moléculaire de ces Acrs de phages virulents inhibant CRISPR-Cas9. Deuxièmement, examiner les effets de l’inactivation des gènes codant pour ces Acrs sur la biologie des phages. Et troisièmement, produire des ‘nanobodies’ (domaines immunoglobuline uniques issus d’anticorps de camélidés) qui, comme les Acrs, inhibent CRISPR-Cas9, et, si possible, des tandems de ‘nanobody’ et d’Acr non chevauchants pour contrôler les technologies de modification des génomes. Les résultats issus de cette recherche profiteront ainsi au niveau fondamental à de nombreux domaines des sciences de la vie (virologie, microbiologie, évolution, biochimie, biologie structurale), et aideront au niveau appliqué au développement d’outils de régulation de CRISPR-Cas9 indispensables pour des applications cliniques. Dans l’ensemble, ce projet aura très certainement un impact à long terme au niveau sociétal et économique, en plus des avancées scientifiques à court et moyen termes.