Identification et caractérisation des facteurs chez la plante qui contrecarrent la suppression de l'ARN silencing par les bactéries – PRIM

Nous avons réalisé une mutagenèse par EMS afin d’identifier des mutants qui restaurent et/ou augmentent l'ARN silencing en présence d'un effecteur bactérien. Le screen, réalisé à l’œil nu, est basé par la sélection de mutants restaurant une chlorose associée à une augmentation de l'ARN silencing dans les lignées senseurs transgéniques produites à cet effet.

Nous avons pu montrer que les composants majeurs de l’ARN silencing jouent un rôle crucial au niveau des stomates, en contrôlant l’ouverture de ces derniers, en réponse à l’infection bactérienne, restreignant ainsi l’invasion de la bactérie chez l’hôte. En outre, nous avons réalisé un crible génétique ‘forward’ pour retrouver des régulateurs négatifs de l'ARN silencing, dont leur inactivation supprime l’action desc suppresseurs bactériens chez Arabidopsis. La caractérisation phénotypique d’une vingtaine de candidats est prometteuse.

De tels mutants coderont probablement de nouveaux répresseurs endogènes de l’ARN silencing, dont l’inactivation devrait augmenter la résistance des plantes face aux infections bactériennes. Nous sommes en train d’identifier les gènes mutés et de caractériser leur fonction à la fois dans l’immunité innée des plantes et l’ARN silencing. Enfin, nous déterminerons si ces nouveaux facteurs sont conservés chez les plantes cultivées. Nous espérons par cette approche, exploiter ces nouveaux facteurs pour augmenter la résistance des plantes.

Un premier article sur le rôle de l'ARN interférence dans les stomates dans la réponse antibactérien est en cours de préparation et devrait être soumis pour début 2018.

La réponse immunitaire innée est la première ligne de défense contre les pathogènes et joue un rôle important dans la défense antibactérienne. Cette réponse est initiée par des récepteurs de surfaces qui reconnaissent les PAMPs (Pathogen-Associated Molecular Patterns) et active le PTI (PAMP-triggered immunity). Les plantes et les animaux contiennent des récepteurs qui détectent la présence de déterminants de virulence des agents pathogènes, tels que les effecteurs, par des récepteurs qui induisent l’ETI (Effector-Triggered Immunity). Ces deux réponses, PTI et ETI, sont associées à une importante reprogrammation transcriptionnelle conduisant à l’expression différentielle de centaines de gènes dont les siRNAs (short interfering RNA) et les miRNAs (microRNA). Récemment, plusieurs siRNAs et miRNAs ont été identifiés comme étant des régulateurs du PTI et de l’ETI suggérant que l’ARN silencing joue un rôle clé dans la régulation du système immunitaire chez les plantes.

L’ARN silencing est un mécanisme eucaryote conservé qui réprime l’expression de gènes de manière séquence-spécifique via des petits ARN guides. Il contrôle l’expression des gènes au niveau transcriptionnel (TGS, Transcriptional Gene Silencing) et post-transcriptionnel (PTGS, Post-transcriptional Gene Silencing). Chez les plantes, le PTGS joue un rôle central dans la résistance contre les virus, les bactéries, les champignons et les oomycètes. Cependant, pour préserver leur pathogénicité, les agents pathogènes ont développé des stratégies qui répriment le PTGS. Ainsi, plusieurs virus à ARN codent des protéines VSR (Viral Suppressors of RNA silencing) qui interfèrent avec la biosynthèse et/ou l’activité des petits ARNs. La bactérie Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 (Pto DC3000) a aussi développé des protéines sécrétées de type III qui suppriment l’ARN silencing. Néanmoins, le mode d’action de ces BSRs (Bacterial Suppressors of RNA silencing) reste indéterminé. Récemment, des études chez Arabidopsis ont montré que deux BSRs de DC3000 peuvent interférer avec la fonction de la protéine ARGONAUTE1 (AGO1) qui est un composant clé du RISC (RNA-Induced Silencing Complex) chez les plantes. Par exemple, le BSR HopT1-1 possède des motifs glycine-tryptophane (GW/WG) qui lui permettent d’interagir directement avec AGO1 et supprimer ainsi sa fonction. Ces motifs sont présents dans certains facteurs endogènes de l’ARN silencing et constituent des plateformes de liaison avec AGO1. Il est intéressant de noter que des déterminants de virulence de virus et d’oomycètes contiennent aussi ces motifs GW/WG suggérant que de nombreux phytopathogènes ont probablement évolué une stratégie de virulence analogue pour permettre l’infection.

Nous proposons d’identifier des mutations qui restaurent l’activité du PTGS en présence du BSR HopT1-1 par un crible génétique « forward » chez Arabidopsis thaliana. Ce crible se fera dans les tissus représentant les sites majeurs d’entrée du phytopathogène, à savoir les hydathodes et les stomates. Ensuite, nous sélectionnerons les mutants qui montreront un défaut d’entrée du pathogène et les gènes mutés correspondants seront identifiés par une approche de cartographie par séquençage. Nous anticipons le fait que certains de ces mutants codent des régulateur négatifs clés du PTGS, dont l’inactivation devrait contrecarrer la suppression de l’ARN silencing induite par l’agent pathogène, conduisant ainsi à une augmentation de résistance. Une caractérisation approfondie de la fonction de ces gènes candidats au niveau de l’ARN silencing et de l’immunité sera effectuée. Dans l’ensemble, cette proposition devrait permettre une meilleure compréhension chez les plantes des mécanismes du PTGS et de la contre-contre défense de l’hôte. De plus, cela fera émerger de nouvelles stratégies qui pourront être utilisées chez les plantes pour contrôler la propagation des agents pathogènes et ainsi ouvrir de nouveaux horizons dans le domaine des applications agronomiques.