Etude fonctionnelle et structurale pour comprendre comment les CDPS détournent des ARNt aminoacylés – CDPS-hijacker

Le travail consiste en des essais cinétiques et des caractérisations biochimiques, biophysiques et structurales (utilisant de la calorimétrie, de la fluorescence, de la cristallographie, des analyses par SAXS, ...) des interactions contractées entre les CDPS, les aa-ARNt, des petits ligands du site actif, et d'autres protéines pertinentes.

Les résultats déjà obtenus ne sont pas encore publiés.

Le projet a l'ambition de donner une vision intégrée du fonctionnement des CDPS dans la cellule, en relation avec le système de synthèse ribosomique des protéines.
Les connaissances fondamentales issues de ce projet pourront donner accès à l'ingénierie des CDPS pour produire des molécules bioactives.

Les résultats déjà obtenus ne sont pas encore publiés.

Les synthases de cyclodipeptides (CDPS) constituent une famille d’enzymes originales, identifiée par le partenaire 1 du présent projet (Gondry et al. 2009 Nat Chem Biol 5, 414). Elles utilisent des aminoacyl-ARNt (aa-ARNt) comme substrats pour synthétiser des cyclodipeptides, qui sont précurseurs de nombreux métabolites secondaires de type dicétopipérazine. Ces composés suscitent un intérêt croissant du fait de leurs activités biologiques diverses et remarquables (Borthwick 2012 Chem Rev 112, 3641).
Le partenaire 1 a résolu la structure cristallographique de la CDPS AlbC de S. noursei. Deux autres structures de CDPS sont disponibles (Belin et al 2012 Nat Prod Rep 29, 961). Toutes présentent une architecture commune similaire à celle du domaine catalytique des aa-ARNt synthetases (aaRS) de classe Ic alors qu’elles ont moins de 15% d’identité de séquence. Les CDPS constituent ainsi un exemple original de l’exaptation des aaRS dans des processus non liés à la synthèse ribosomale des protéines. Elles ont non seulement divergé à partir des aaRS conventionnelles mais aussi acquis un nouveau site actif qui les a converties en des enzymes utilisant désormais les aa-ARNt comme substrats pour catalyser la formation de cyclodipeptides.
Les propriétés particulières des CDPS en font un sujet d’étude particulièrement original et beaucoup de questions demeurent encore sans réponse quant à leur fonctionnement. Les différentes étapes de leur mécanisme sont ainsi loin d’être toutes décrites et les interactions qu’elles contractent avec leurs deux substrats aa-ARNt sont peu documentées. Le fonctionnement des CDPS pose également de nombreuses questions sur leur intégration dans le métabolisme cellulaire des aa-ARNt. En effet, le rôle principal de ces aa-ARNt est d’être utilisés comme substrats pour la synthèse ribosomale des protéines. Pour cela, les ARNt, une fois aminoacylés, deviennent des ligands très affins du facteur d’élongation EF1A (EF-Tu) qui les délivre au ribosome. Comment, dans ce contexte, les CDPS détournent-elles des aa-tRNAs libres, utilisables comme substrats ?
Notre projet est un projet de recherche fondamentale qui vise à comprendre comment les CDPS sont capables de détourner des aa-ARNt pour catalyser la formation de cyclodipeptides. Pour atteindre cet objectif, notre travail consistera à (i) fournir une description précise des événements catalytiques au site actif des CDPS, (ii) préciser les bases moléculaires des interactions entre les CDPS et leur deux substrats et (iii) examiner les relations cellulaires entre les CDPS et EF1A qui utilisent tous deux des aa-ARNt comme substrats. Ce travail comportera des études cinétiques et la caractérisation tant biochimique et biophysique que structurale des interactions mises en jeu entre les CDPS et des petits ligands du site actif, des aa-ARNt, le facteur EF1A, voire des aaRS. Il combinera les expertises complémentaires des deux partenaires. Le partenaire 1 possède une solide expérience dans la production et la manipulation de nombreuses CDPS et de leurs variants. Il a mis au point les tests enzymatiques permettant de mesurer l'activité des CDPS. Le partenaire 2 possède des compétences reconnues dans le domaine de la synthèse ribosomale des protéines et manipule régulièrement les autres protéines requises (EF1A et aaRS) ainsi que les aa-ARNt. Il a également développé une expertise importante pour les méthodes biophysiques (ITC, spectroscopie de fluorescence) et les méthodes structurales (cristallographie et SAXS) qui sont indispensables à la réalisation du projet. Par ailleurs, les deux partenaires auront accès à une méthode innovante d’interférométrie (BSI).
Le projet a l’ambition de donner une vision globale du fonctionnement des CDPS, en relation avec le système de synthèse ribosomale des protéines. Les connaissances fondamentales acquises pourront être utilisées dans le futur pour une ingénierie moléculaire des CDPS dans le but de produire des molécules d’intérêt pharmacologique.