Nouveaux procédés de spectroscopie Raman pour l’analyse d’agents biologiques – NEOSPRAM

Disposer d’une capacité de détection rapide, en quasi temps réel, des particules micrométriques contenues dans un échantillon est essentiel dans de nombreux domaines. Une telle capacité peut intéresser les forces armées pour leur permettre de détecter rapidement la présence éventuelle d’agents pathogènes dispersés dans l’air par un agresseur sur un théâtre d’opération. Les méthodes de biologie moléculaire sont trop lentes pour fournir une alerte dans ce délai tandis que les détecteurs capables de répondre en quelques secondes actuellement disponibles sur étagère présentent des niveaux de performance en termes de sélectivité/sensibilité qui doivent encore être améliorés.
Les travaux rapportés dans la littérature depuis quelques années suggèrent qu’il pourrait être possible d’extraire des signatures suffisamment robustes à partir des spectres de bactéries, virus et moisissures obtenus par microspectroscopie Raman. Une voie prometteuse consiste donc à intégrer une détection par spectroscopie Raman au sein d’un cytomètre en flux liquide. Pour que ce dernier ait des performances de sensibilité suffisantes au regard du besoin opérationnel, il doit pouvoir analyser un flux de l’ordre de quelques milliers de particules par seconde. Sa sélectivité dépendra, quant à elle, de la richesse des spectres Raman acquis à cette fréquence. Cependant, les temps d’acquisition actuellement nécessaires pour obtenir des spectres de bonne qualité, sont incompatibles avec le débit recherché de la cytométrie en flux.
Le but du projet NEOSPRAM est de développer de nouveaux procédés de spectroscopie Raman non-linéaire, compatibles avec les exigences de la cytométrie en flux à haut débit, permettant simultanément d’acquérir des spectres Raman d’agents biologiques avec une fréquence typique de l’ordre de quelques milliers de spectres par seconde, un rapport signal sur bruit, une résolution spectrale et une richesse compatible avec leur classification au niveau de l’espèce.
Nous chercherons d’abord à diminuer, par une approche physique originale, le bruit de fond non résonant qui constitue un obstacle important à l’intégration de la spectroscopie par diffusion Raman anti-Stokes cohérente multiplexe (M-CARS) dans un cytomètre à haut débit. Nous étudierons en parallèle un nouveau procédé de spectroscopie par diffusion Raman stimulée multiplexe (M-SRS) combinant une onde de pompe monochromatique et une onde Stokes engendrée par une source laser supercontinuum.
Afin d’enrichir le spectre des agents biologiques modèles étudiés dans ce projet, nous développerons ensuite une spectroscopie Raman non-linéaire multimodale et augmentée, de façon à étendre le spectre Raman dans plusieurs dimensions.
Ces procédés seront mis en œuvre par un instrument robuste et peu onéreux intégrant une source laser compacte, tous deux construits dans le cadre de ce projet.
Dans une dernière partie, nous évaluerons l’intérêt de ces nouveaux procédés en les appliquant au problème de la classification au niveau de l’espèce des agents biologiques modèles utilisés dans ce projet. En utilisant des méthodes d’analyse multivariée, nous comparerons les performances obtenues avec celles de l’état de l’art. Nous en déduirons pour conclure certaines exigences techniques clés que devrait satisfaire un détecteur d’alerte biologique utilisant la cytométrie en flux activée par spectroscopie Raman.