Structures et Mécanismes réactionnels de galactosyltransférases – Meca-GT

L’approche utilisée fait appel à des méthodes de cristallographie et de modélisation moléculaire pour le volet structural. Le projet comporte le développement de nouveaux outils et méthodes pour l’étude de ces enzymes : (i) des tests fluorescents (ciblant le substrat donneur UDP-Gal) dédiés à une stratégie de criblage de l’activité de la b4GalT7, (ii) synthèse d’une glycothèque de dérivés du xylose qui seront testés pour leur capacité à être substrats et/ou inhibiteurs de la b4GalT7. Le criblage d’une chimiothèque est aussi planifié et les composés « têtes de série » seront évalués comme modulateurs de la synthèse des glycosaminoglycannes à visée thérapeutique.

Rapport à 18 mois:
Les outils, molécules et méthodes pour la caractérisation structurale et fonctionnelle des deux glycosyltransférases modéles (BGB et hb4GalT7) sont pour la plupart en place.
BGB : la cristallisation de la BGB se fait en routine. Des complexes ont été obtenus avec trois types de composés cagés (dérivés d’UDP-Gal) et les premières expériences de photolyse ont été réalisées. Une approche de cristallographie cinétique de type « déclencher-décongeler » (Trigger-Freeze) a été appliquée à la BGB en complexe avec UDP-Gal et UDP-GalNAc. Cette technique a permis d’obtenir pour la première fois l’enzyme en complexe avec un UDP-GalNAc intact. La flexibilité structurale de l’enzyme a été étudiée par dynamique moléculaire (analyse des modes normaux) afin de mieux comprendre les évènements accompagnant la fixation des substrats donneur et accepteur, et notamment le passage d’une forme ouverte inactive, à une forme fermée active.
Hb4GalT7 : la cristallisation de cette enzyme n’a pas encore été obtenue, mais un modèle moléculaire a permis d’explorer le site accepteur de l’enzyme qui a été ensuite validé par mutagenèse dirigée par des tests in vitro et in cellulo. Une collection de huit xylosides possédant différents aglycones fluorescents et modifiés en position 2 ou 4 par des H ou des fluors ainsi que des UDP-Gal fluorescents ont été synthétisés. L’un des dérivés xylosides testés a montré un potentiel inhibiteur marqué pour ce dernier (réduction d’environ 50% de la biosynthèse des GAGs in cellulo).
Une technologie appelée « Glyco-Fluo » a été développée et sera utilisée pour des essais de criblage de molécules ciblant l’activité b4GalT7.

L’optimisation des conditions de cristallisation de la hb4GalT7 sera poursuivie par l’obtention d’une forme plus courte de l’enzyme et par l’amélioration du protocole de purification. La synthèse de nouveaux xylosides modifiés sera poursuivie pour enrichir la glycothèque existante. Les premiers tests de cristallographie cinétique seront réalisés par l’approche dite «Freeze-Trigger” en utilisant le compose-cagé le plus prometteur sur la base des résultats préliminaires obtenus. Un dosage de type HTS sera mis au point pour permettre le criblage de banques de produits. Les meilleurs hits seront évalués par des tests in silico, in vitro et in cellulo.

1. Jørgensen R., Batot G., Mannerstedt K., Imberty A., Breton C., Hindsgaul O., Royant A. and Palcic M.M. (2014) Structures of a human blood group glycosyltransferase in complex with a photo-activatable UDP-Gal derivative reveal two different binding conformations. Acta Cryst. F70, 1015–1021
2. Saliba M., Ramalanjaona N., Gulberti S., Bertin-Jung I., Thomas A., Dahbi S., Lopin-Bon C., Jacquinet J-C., Breton C., Ouzzine M., and Fournel-Gigleux S. (2015) Probing the acceptor active site organization of the human recombinant ß1,4-galactosyltransferase 7 and design of xyloside-based inhibitors. J. Biol. Chem., 290, 7658-7670.
3. Pérez S., Sarkar A., Rivet A., Breton C. & Imberty A. (2015) Glyco3D: A portal for structural glycosciences. Glycoinformatics, Methods Mol. Biol. 1273, 241-258.
4. FOURNEL-GIGLEUX S., GULBERTI S., BERTIN-JUNG I., RAMALANJAONA N., LOPIN-BON C., JACQUINET J.C., OUZZINE M. (2014) Conjugués glucidiques fluorescents, leur procédé de préparation et leurs utilisations. PAT2503562FR00 – Dépôt Septembre 2014

Les glycosyltransférases (GTs) constituent une vaste famille d’enzymes qui catalysent le transfert d’un résidu saccharidique, à partir d’un donneur de sucre activé (le plus souvent un nucléotide-sucre) sur un accepteur qui peut être un sucre, une protéine, un lipide ou toute autre petite molécule. Les GTs sont donc les enzymes clé de la synthèse des oligo- et polysaccharides et des très nombreux glycoconjugués cellulaires, molécules aux rôles biologiques extrêmement variés allant du rôle structural, énergétique ou encore dans la régulation de la signalisation cellulaire. La diversité des produits naturels glycosylés est également largement exploitée par l’industrie pharmaceutique dans sa quête de nouvelles molécules actives (ex : antibiotiques, anti-diabétiques et anti-cancéreux). Des altérations de la glycosylation, à la fois qualitatives et quantitatives, sont observées dans de nombreuses situations pathologiques (cancer, arthropathies, inflammation, ...), et les GTs constituent donc des cibles particulièrement prometteuses dans la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les données structurales disponibles pour ces enzymes ont montré la surprenante conservation de leur architecture tridimensionnelle, puisque seuls deux types de repliement ont été caractérisés à ce jour. En dépit de leur intérêt comme cibles thérapeutiques, les GTs restent à ce jour encore mal connues, ce qui constitue un frein au développement d’inhibiteurs performants. La complexité du mécanisme réactionnel de ces enzymes et leur étonnante plasticité conformationnelle sont à l’origine des difficultés rencontrées dans leur étude. L’objectif principal de ce projet est de progresser dans notre connaissance du mécanisme d’action des GTs. Nous allons concentrer notre effort sur deux GTs humaines : (i) la BGB, enzyme de synthèse du groupe sanguin B, et (ii) la b4GalT7, une enzyme clé de la synthèse des chaînes polysaccharidiques (glycosaminoglycannes) des protéoglycannes. L’approche utilisée fera appel à la cristallographie cinétique et aux outils de modélisation moléculaire pour tenter de mieux comprendre comment ces protéines fonctionnent. Le projet comprend également une étude structurale approfondie de la b4GalT7 humaine qui représente une cible potentielle pour le traitement de certaines maladies telles que les arthropathies et le cancer. L’objectif principal est d’obtenir la structure tridimensionnelle de cette enzyme en complexe avec des ligands (substrats/inhibiteurs). Parallèlement aux études structurales, le projet comporte le développement de nouveaux outils et méthodes pour l’étude de ces enzymes (ex : des tests fluorescents dédiés à une stratégie de criblage et permettant le suivi en temps réel de l’activité GT). Il inclut également la synthèse d’une glycothèque de dérivés du xylose qui seront testés pour leur capacité à être substrats et/ou inhibiteurs de la b4GalT7. L’ensemble des informations structurales et mécanistiques qui sera issue de ces travaux devrait permettre à terme de mieux comprendre les évènements moléculaires se produisant lors de la réaction de transfert et fournir de nouvelles pistes pour la recherche d’inhibiteurs performants. Afin d’élargir notre stratégie de recherche de nouvelles molécules effectrices pour notre cible thérapeutique, le criblage d’une chimiothèque sera réalisé et les composés « têtes de série » seront évalués comme modulateurs de la synthèse des glycosaminoglycannes à visée thérapeutique.