Mécanismes originaux impliqués dans la radiorésistance exceptionnelle de la bactérie Deinococcus radiodurans – Radioresistance

La bactérie D. radiodurans est facilement manipulable génétiquement et son génome est entièrement séquencé. Des stratégies d’inactivation de gènes permettent de créer des banques de mutants et d’identifier par criblage de ces banques de nouveaux gènes impliqués dans la radiorésistance et/ou dans des réseaux de régulation. De plus, il est possible en fusionnant des protéines à des étiquettes de les localiser dans la cellule par microscopie à fluorescence et de suivre la chorégraphie de leur cible quand elles se fixent sur l’ADN.

Le projet ayant démarré il y a 6 mois, pour l’instant les outils ont été mis en place, la faisabilité des stratégies a été validée. Une banque de mutants a été construite, de nouveaux mutants radiosensibles ont été isolés et sont en cours de caractérisation et un système a été mis au point chez D. radiodurans pour suivre dans la cellule au cours du temps la position de régions chromosomiques par microscopie à fluorescence.

Notre projet vise à mieux comprendre toutes les particularités de la bactérie D. radiodurans qui pourraient conférer la résistance aux radiations et plus généralement aux agents qui endommagent l’ADN et en tirer des leçons pour mieux comprendre la résistance des cellules tumorales à la radiothérapie et/ou la chimiothérapie.

Le projet a démarré il y a 6 mois, durée insuffisante pour produire des publications ou des brevets. On peut attendre des publications sur ce sujet neuf courant 2013.

La tolérance exceptionnelle de la bactérie Deinococcus radiodurans à de fortes doses de radiations ionisantes est la résultante de plusieurs facteurs ; on peut citer une réparation très efficace des cassures double brin de l’ADN, une protection des protéines contre l’oxydation et une structure compacte du nucléoïde maintenue après irradiation. Il a également été proposé que les copies multiples des chromosomes soient préalignées facilitant ainsi la réparation des cassures de l’ADN mais cette hypothèse n’a jamais été prouvée. L’analyse du transcriptome de D. radiodurans a permis la mise en évidence d’une série de gènes induits après irradiation, incluant plusieurs gènes de fonction inconnue et spécifiques des Deinococcaceae. Les mécanismes de régulation responsables de cette réponse aux radiations ne sont toujours pas élucidés.
Notre projet vise
(1) à identifier de nouveaux gènes et processus impliqués dans la radiorésistance en construisant une banque de mutants d’insertion basée sur une mutagenèse par transposition. La banque sera criblée pour la radiosensibilité des mutants, les gènes inactivés correspondants seront ensuite identifiés par PCR arbitraire et séquençage des produits PCR. Les mutants radiosensibles seront caractérisés pour la protection de leurs protéines contre l’oxydation, la structure de leur nucléoïde, la cinétique de réparation des cassures de l’ADN et leur capacité de promouvoir une synthèse massive d’ADN au cours du réassemblage de leur génome, ceci afin d’attribuer une fonction aux nouveaux gènes identifiés.
(2) à élucider le réseau de régulation mis en place en réponse aux radiations ionisantes en identifiant et caractérisant (i) le(s) gène(s) codant le régulateur qui se fixe au motif RDRM (Radiation/Dessication Response Motif) trouvé en amont des gènes induits par l’irradiation en mettant à profit un système de sélection de cellules résistantes à la streptomycine (ii) les gènes impliqués dans la régulation de la réponse aux radiations par criblage d’une banque de mutants d’insertion dérégulés pour l’expression d’un gène rapporteur fusionné à un promoteur d’un gène fortement induit après irradiation
(3) à tester le préalignement des chromosomes en utilisant le système FROS (Fluorescent Repressor Operator System) chez D. radiodurans. Pour localiser des régions précises de chacune des copies de chromosomes et pour tester leur colocalisation dans le nucléoïde, nous construirons des souches exprimant le répresseur LacI fusionné à GFP (Green Fluorescent Protein) et contenant des répétitions de l’opérateur lacO insérées dans les régions à localiser. Nous ciblerons plusieurs régions du génome et analyserons par microscopie à épifluorescence le nombre de foci GFP par cellule. Ce travail permettra (i) de prouver ou d’infirmer l’hypothèse de l’alignement des chromosomes avant et/ou après irradiation (ii) de suivre la dynamique la chorégraphie des origines de réplication au cours du cycle cellulaire.