Elucidation du métabolisme de l’undécaprényl phosphate, un lipide essentiel pour la biosynthèse des polymères de la paroi bactérienne – BACTOPRENYL

Ce projet développe en particulier une étude pluridisciplinaire de multiples protéines intégrales de membrane, incluant l’analyse de leurs rôles physiologiques, mécanismes catalytiques, topologies membranaires et régulation. La connaissance générale sur les protéines membranaires est encore très limitée actuellement en raison des difficultés inhérentes à leur étude ; ce projet se place donc également dans une perspective ambitieuse d’accroissement de nos connaissances dans ce domaine particulier.

Identification et clonage des gènes codant pour des activités de type undécaprényl-pyrophosphate phosphatase appartenant à deux familles protéiques distinctes, BacA et PAP2, chez diverses espèces bactériennes. Analyse du caractère essentiel de ces gènes et construction de souches mutantes conditionnelles. Purification à homogénéité à l'échelle du mg de plusieurs de ces enzymes, protéines intégrales de membrane à multiples segments transmembranaires.

Le transporteur lipidique undécaprényl-phosphate et son métabolisme, qui sont indispensables à la synthèse du peptidoglycane et de divers autres polymères essentiels de la paroi bactérienne, et donc au maintien de l’intégrité cellulaire, constituent des cibles de choix potentiellement exploitables pour une recherche de nouveaux agents antibactériens. Les résultats générés au cours de la présente étude, notamment la connaissance des mécanismes catalytiques et de la spécificité de substrats, de la topologie membranaire, ainsi que de la structure cristallographique des enzymes impliquées dans la biosynthèse et/ou le recyclage de ce lipide, seront donc potentiellement applicables à une telle démarche.

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La biosynthèse des divers polysaccharides constituant la paroi bactérienne, tels que le peptidoglycane, implique le transfert d’unités glycanes au travers de la membrane cytoplasmique. Cette étape de translocation requiert un transporteur lipidique, l’undécaprényl phosphate (C55-P). Le chargement des glycanes sur ce lipide s’effectue à la face cytoplasmique de la membrane, générant ainsi une série d’intermédiaires de type C55-PP-sucre(s). Ces derniers sont transloqués de l’autre côté de la membrane (flip-flop) à l’aide de flippases et les glycanes sont transférés sur des accepteurs (polymères en extension). Le transporteur est libéré à ce stade sous une forme pyrophosphorylée « inactive » qui doit alors être recyclée. Le C55-P est utilisé pour la synthèse de différents polymères essentiels au maintien de l’intégrité cellulaire. Son rôle est donc fondamental, l’inhibition de sa biosynthèse conduisant à l’arrêt de synthèse du peptidoglycane et donc à la lyse cellulaire. Le C55-P résulte de la déphosphorylation de l’undécaprényl-pyrophosphate (C55-PP), lui-même généré par synthèse de novo ou recyclé à la fin des étapes de polymérisation. La synthèse de novo du C55-PP est catalysée par la synthase UppS, une enzyme caractérisée en détail sur les plans biochimique et mécanistique. L’étape de déphosphorylation du C55-PP avait par contre été très peu étudiée jusqu’à ce que les partenaires 1 et 3 du présent projet en développent l’analyse approfondie. Deux familles distinctes de protéines présentant une activité C55-PP phosphatase (UppP) ont alors été identifiées chez Escherichia coli : BacA d’une part et trois membres de la super-famille de phosphatases PAP2 (PgpB, YbjG et YeiU) d’autre part. La détection de gènes orthologues putatifs en nombre variable dans les autres génomes a montré que cette redondance d’activités était conservée au sein du monde bactérien, posant alors la question du rôle physiologique d’une telle multiplicité. Une découverte inattendue faite récemment par le partenaire 1 a été de constater que l’une de ces enzymes, YeiU, catalysait in vitro comme in vivo le transfert du phosphate libéré lors de la réaction de déphosphorylation du C55-PP sur le lipide A, un motif structural essentiel des lipopolysaccharides (LPS). Le rôle physiologique de la modification structurale des LPS (lipide A pyrophosphorylé) ainsi générée via cette activité « phosphotransférase » additionnelle de YeiU reste encore à élucider. De façon intéressante, ce résultat conduit à émettre l’hypothèse générale que ces multiples C55-PP phosphatases bactériennes pourraient toutes présenter ce type d’activité et être ainsi impliquées dans la modification structurale spécifique de divers composants de l’enveloppe. Ces réactions devant jouer un rôle essentiel dans la régulation d’activités cellulaires et/ou dans l’adaptation à différentes situations physiologiques ou de stress.
Le but du présent projet vise à une complète élucidation du métabolisme du transporteur lipidique undécaprényl phosphate bactérien, via diverses approches complémentaires et pluridisciplinaires menées en parallèle chez plusieurs bactéries modèles à Gram-négatif et Gram-positif. En particulier, les multiples C55-PP phosphatases que nous avons récemment identifiées feront l’objet d’une étude approfondie : propriétés enzymatiques, mécanismes catalytiques, expression et régulation, fonctions respectives dans le métabolisme du C55-P, la physiologie bactérienne et la virulence. Deux autres enzymes (C55-P phosphatase et undécaprénol kinase) impliquées dans le métabolisme du C55-P qui à ce jour n’ont toujours pas été identifiées feront également l’objet de cette étude. Seuls des aspects fondamentaux seront développés au cours du projet. Cependant, il est clair que la connaissance acquise sur ce métabolisme bactérien essentiel et sur les enzymes qui y sont impliquées pourra être exploitée dans le cadre d’une recherche de nouveaux agents antibactériens.