Rôle de la protéine TRF2 et de ses partenaires dans la formation et la stabilité de la t-loop des télomères humains – TELOLOOP

Notre étudie allie diverses techniques de la biologie structurale, moléculaire, cellulaire et de la biochimie. Dans les cellules, nous étudions la formation de la T-loop, son élimination et les protéines participant à ces processus. Pour les mécanismes précis, nous construisons des modèles et étudions ces mêmes réactions dans le tube à essai (Biochimie). Enfin les structures 3D sont étudiées par différentes méthodes biophysiques.

Les études que nous avons réalisées pendant ces derniers 18 mois ont été particulièrement dédiées à la mise en place des techniques et à la production d’outils nécessaires à la suite de notre projet. Nous avons aussi obtenus des résultats significatifs :
- Des résultats que nous avons publiés dans un journal international (Nucleic Acids Research) montrent le rôle important joué par le premier domaine de la protéine TRF2. Ce domaine, suivant sa nature et les modifications qu’il peut subir, peut transformer radicalement les propriétés de cette protéine.
- Nous avons révélés un rôle important de trois protéines dans l’élimination de la T-loop, GEN1, Mus81, SLX4.
- Nous avons mis au jour des domaines fonctionnels dans la protéine SLX4, une des protéines impliquées dans l’élimination de la T-loop qui pourraient jouer un rôle important dans ses fonctions aux télomères.
- Nous avons obtenu l’image 3D à faible résolution de la protéine TRF2 et du complexe entre TRF2 et son partenaire RAP1.

Durant les prochains 18 mois, l’accent sera donné sur quatre axes principaux:
- Les outils biochimiques produits (protéines et ADN) seront utilisés pour élucider le mécanisme de formation des T-loops. Nous espérons ainsi décrire quels domaines de la protéine TRF2 sont impliqués et quels partenaires de cette protéine participent à la réaction.
- Un mutant de TRF2 que nous avons produits va nous permettre de déterminer le rôle exact des T-loop dans la protection des télomères.
- A l’aide de mutants, nous étudierons le rôle des domaines fonctionnels de la protéine SLX4, que nous avons découverts, dans l’élimination des T-loops.
- Nous tenterons d’obtenir des structures 3D des protéines TRF2 et RAP1 seules ou en interaction avec l’ADN à faible et haute résolution (résolution atomique)

Nous avons publié un article en commun dans un journal international :
Poulet A, Pisano S, Faivre-Moskalenko C, Pei B, Tauran Y, Haftek-Terreau Z, Brunet F, Le Bihan YV, Ledu MH, Montel F, Hugo N, Amiard S, Argoul F, Chaboud A, Gilson E, Giraud-Panis MJ. The N-terminal domains of TRF1 and TRF2 regulate their ability to condense telomeric DNA. Nucleic Acids Research, 2012, 40, 2566-2576.

S’il est maintenant acquis que les télomères jouent un rôle crucial dans la stabilité du génome et dans la viabilité des cellules, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces fonctions sont encore à élucider. De nombreuses données attestent du rôle majeur joué par les télomères dans le développement et le maintien des cancers ainsi que dans le vieillissement des organismes. En effet, les télomères raccourcissent à chaque division cellulaire entraînant la sénescence dite réplicative, un phénomène considéré comme anti-tumoral et que l’on pense impliqué dans le vieillissement. Toutefois, ce n’est pas tant la taille des télomères qui définit la fonctionnalité de ces éléments chromosomiques mais d’autres paramètres sont également cruciaux tels que leur repliement et la dynamique des complexes protéiques qui les composent. Dans les cellules humaines, un de ces complexes est particulièrement impliqué il est nommé shelterin ou télosome. Ce complexe est constitué de 6 protéines télomériques, TRF1, TRF2, RAP1, TIN2, TPP1, POT1. Toutefois, il n’est pas le seul intervenant dans les fonctions télomériques puisque d’autres sous-complexes ont pu être identifiés et il a pu être montré que certaines des protéines qui le composent présentent des fonctions autonomes. Ainsi TRF1 est impliqué dans la régulation de la taille des télomères et POT1 participe à la fois à cette régulation et à la protection des télomères. TRF2 et ses partenaires empêchent la reconnaissance des extrémités télomériques par les protéines de point de contrôle et les recombinases. Le repliement des télomères sous la forme d’une boucle appelée T-loop est pressentie comme un mécanisme important dans cette protection. Cette structure a été observée par microscopie électronique sur des télomères extraits de cellules diverses et se forme in vitro en présence de TRF2 et d’ADN télomérique portant une extrémité simple brin. Certaines données laissent suggérer que la formation de cette boucle implique une invasion en cis de l’extrémité simple brin dans la double hélice. Il se créé ainsi au pied de la boucle une structure complexe portant une « D-loop » (sorte de bulle d’ADN) et une jonction de Holiiday (structure à quatre brins d’ADN connue comme un intermédiaire de la recombinaison génétique homologue). Le partenaire 1 a récemment publié deux articles (Amiard et al., Nature Struct. & Mol. Biol. 2007, Poulet et al., EMBO J 2009) révélant , par des expériences in vitro, deux propriétés intrinsèques de TRF2 qui pourraient participer à la formation et à la maintenance des T-loops: i) TRF2 est capable de stimuler l’invasion d’un simple brin télomérique dans une double hélice par un phénomène de modification de la topologie de l’ADN. ii) Par la fixation de son domaine N-terminal au centre de la jonction de Holliday, TRF2 protège cette structure contre la coupure par les résolvases de la recombinaison homologue. Basé sur ces deux publications, le projet TELOLOOP que nous présentons propose d’explorer à la fois in vitro et dans les cellules la formation de la T-loop, sa sensibilité à différentes activités nucléolytiques et le rôle de TRF2 et de ces partenaires dans ces processus. Organisé en 4 tâches très interdépendantes, ce projet implique 4 partenaires amenant des compétences très variées permettant d’allier ainsi des expériences de biologie cellulaire (Partenaire 1 et 2), de Biochimie (Partenaire 1), de molécule unique (Partenaire 3), de Biologie Structurale (Partenaire 4). L’originalité de ce projet tient d’une part dans cette multidisciplinarité, peu fréquente dans le domaine des télomères, et d’autre part dans l’aspect novateur des concepts qui le sous-tendent. Ainsi nous pensons que le projet TELOLOOP devrait générer des avancées scientifiques à la fois conceptuelles et technologiques importantes.