ARN et microfluidique : analyse cinétique du repliement des ARN dans la régulation – RNAµfluidics

L'ARN, qui a longtemps été considéré comme un support d'information passif , est maintenant largement considéré comme une acteur majeur de la régulation de l'expression des gènes. Dans les bactéries, l'ARNm est essentiel à cet égard et la régulation implique des éléments structuraux qui sentent directement l'environnement, ou facilitent l'interaction avec aussi bien un métabolite, un ANR cible, ou des protéines fixant l'ARN. Dans tous ces systèmes la régulation est hautement dépendante d'interrupteurs structuraux qui sont mis en place durant la transcription. Dans ce projet, nous voulons étudier de tels mécanismes et nous intéresser à des questions cinétiques reliées au repliement de l'ARNm. Expérimentalement nous utiliserons des techniques rodées de sondage en solution, mais dans le cadre de la microfluidique qui offre une large gamme de possibilités nouvelles et des avantages par rapport aux systèmes usuels de quenched-flow ou stopped-flow . Parmi ceux-ci on compte la miniaturisation qui permet d'utiliser moins de matériel (et aussi moins de produits chimiques dangereux), ainsi que la possibilité d'accroître la complexité et la subtilité des lignes cinétiques. Nous considèrerons deux systèmes bactériens, d'abord le riboswitch à Thiamine pyrophosphate (TPP) qui controle chez Escherichia coli l'initiation de la traduction du gène thiM et, ensuite, l'ARN III de Staphylococcus aureus qui régule la traduction de plusieurs ARNm différents de facteurs de virulence. L'ARN III est responsable, entre autre, de l'inhibition de la traduction de l'ARNm spa par séquestration de son site de liaison du ribosome ainsi que de l'activation de la traduction de l'ARNm hla en induisant, au contraire, un changement structural facilitant la liaison du ribosome. Nous voulons analyser la cinétique de séquestration depuis le premier événement de reconnaissance (formation d'un complexe boucle-boucle) jusqu'à la formation d'un duplex entre l'ARN III et l'ARNm spa. L'influence de la chaperone Hfq sera étudiée sur l'activation de la traduction de l'ARNm de hla médiée par l'ARN III. Le riboswitch à TPP, dont la structure cristalline est connue et qui a déjà été étudié cinétiquement, sera utilisé dans une première étape comme système modèle pour nous permettre de tester le bien fondé des développements en microfluidique. Ces développements nous permettront de considérer des questions plus complexes sur la cinétique de la régulation médiée par l'ARN. De plus, ils permettront de rapprocher la technologie microfluidique extrêmement prometteuse d'une utilisation à la paillasse dans les laboratoires de biochimie.