Facteur VIII demannosylé recombinant pour le traitement des patients hémophiles A – DEMANNF8

L'hémophilie A est une maladie génétique rare de la coagulation consécutive à l'absence d'une protéine appelée le facteur VIII (FVIII). Le traitement des hémorragies à l'aide de FVIII exogène induit des auto-anticorps qui l'inhibent, ce qui complique le traitement des patients. Dans les pays occidentaux, le traitement annuel d'un patient avec inhibiteurs atteint 190000 euros/an. Nous avons démontré récemment que les sucres mannosylés sur les Asn239 et Asn2118 du FVIII permettent son internalisation par les cellules présentatrices de l'antigène, suivie de sa présentation aux lymphocytes T CD4+ et de l'activation des cellules T.
L'objectif du projet DEMANNF8 est de produire un FVIII recombinant dépourvu de sucres mannosylés, qui serait moins immunogénique que les FVIII recombinantdisponibles commercialement. Nous produirons 4 variants de FVIII recombinant: un FVIII non muté, un FVIII Asn239Ala, un FVIII Asn2118Ala et un FVIII Asn239Ala/Asn2118Ala. A l¿aide du FVIII sauvage comme contrôle, nous vérifierons que 1) les différents FVIII démannosylés sont sécrétés par les cellules eukaryotes, 2) les rendements de production sont compatibles avec un développement industriel ultérieur, 3) l'activité pro-coagulante et la structure des molécules sont préservées, 4) l'immunogénicité est réduite. Nous apporterons ainsi la preuve de concept en faveur d'une nouvelle molécule de FVIII fonctionnelle en tant que co-facteur du facteur IX activé et peu immunogénique. //Notre description du rôle majeur joué par les sucres mannosylés du FVIII sur son immunogénicité in vitro est nouvelle, et fait l¿objet d¿un dépôt de brevet. Nous souhaitons introduire des mutations dans le FVIII afin d¿éliminer des sites de `N-glycosylation' et ainsi prévenir l¿addition de sucres mannosylés au moment de la synthèse du FVIII par les cellules. Aujourd¿hui, de nombreuses molécules de FVIII sont générées par mutagénèse dirigée par les différents groupes industriels internationaux. Les buts poursuivis sont mutliples: augmenter la demi-vie du FVIII thérapeutique, accroître la production du FVIII par les lignées cellulaires au stade de la production industrielle afin d¿abaisser les coûts de production, rendre le FVIII moins antigénique (modification des épitopes reconnus par les anticorps ou les cellules T). En comparaison, notre approche est différente et originale. Nous visons à rendre le FVIII moins immunogénique. L¿élimination des sucres mannosylés empêchera l¿interaction du FVIII avec les récepteurs d¿internalisation présents à la surface des cellules présentatrices de l¿antigène. Nous bloquerons ainsi, en amont de la réponse immunitaire, l¿interaction du FVIII avec les effecteurs cellulaires du système immunitaire. //L¿équipe 1 produit et commercialise du FVIII thérapeutique (Factane)et a développé un FVIII recombinant sans domaine B. Elle maîtrise la caractérisation fonctionnelle et structurale du FVIII, l¿analyse des sucres du FVIII et l¿étude de son immunogénicité chez le chien hémophile. Elle a la connaissance parfaite du marché et de l¿intérêt représenté par le développement d¿un FVIII thérapeutique moins immunogène.
L¿équipe 2 travaille depuis 10 ans sur la réponse immunitaire contre le FVIII chez l¿hémophile. Elle a développé des tests cellulaires pour tester l¿immunogénicité du FVIII et utilise les souris hémophiles. L¿équipe 2 a récemment acquis les outils de biologie moléculaire permettant de produire des protéines recombinantes dans des systèmes eukaryotes.
L¿équipe 3 possède une longue expérience en hémostase, et la connaissance technique pour la production de facteurs de la coagulation recombinants. L¿équipe 3 a récemment acquis le modèle expériemental d¿injection hydrodynamique.
//Notre objectif est de produire un FVIII recombinant moins immunogène que les FVIII thérapeutiques commercialisés. Nous tenterons de réduire l¿immunogénicité du FVIII par mutagénèse dirigée, en remplaçant les Asn239 et 2118 auquels sont fixés les sucres mannosylés, par des résidus Ala.
Dans la première étape (Equipes 2 et 3), nous générerons quatre cDNA codant des variants du FVIII: un FVIII sauvage, un muté en As239, un en Asn2118 et un muté sur les 2. Nous étudierons si les différents variants sont sécrétés par les cellules eucaryotes, et si les rendements de production sont compatibles avec un développement industriel. Si les protéines ne sont pas sécrétées, ou si les rendements sont trop faibles, nous modifierons la structure du FVIII, par exemple en ajoutant un partie du domaine B du FVIII qui porte des sucres mannosylés potentiellement avantageux pour le traffic intracellulaire et la sécrétion des protéines recombinantes.
Les variants seront produits à `échelle moyenne¿ (Equipe 1) de manière à obtenir des quantités suffisantes de chaque protéine pour faire les études in vitro et in vivo.
L¿activité pro-coagulante des différents variants du FVIII (Equipes 1 et 3) sera testée in vitro et in vivo chez les souris hémophiles. L¿intégrité des variants sera validée par l¿étude de leurs structures secondaires et tertiaires (Equipe 1), leur capacité à se lier à des anticorps monoclonaux, à interagir avec le facteur von Willebrand et avec les phospholipides. Une perte importante d¿activité fonctionnelle chez les variants nous encouragera à définir une solution possible au problème. Toutefois, le fait que nous générions plusieurs variants simple ou double-mutés, augmente la chance de trouver un variant dont les propriétés pro-coagulantes sont intactes.
L¿immunogénicité des variants du FVIII sera étudiée in vitro (Equipe 2) à l¿aide de tests d¿endocytose et d¿activation de lymphocytes T, et in vivo en utilisant des souris (Equipes 2 et 3) ou des chiens hémophiles (Equipe 1). In vitro, l¿immunogénicité respective des différentes molécules sera exprimée en quantité de FVIII nécessaire pour atteindre 50% d¿endocytose ou 50% d¿activation des cellules T.
In vivo, l¿immunogénicité sera exprimée en titres d¿inhibiteurs du FVIII dans le plasma (Unités Bethesda par ml). Il est possible que le modèle de souris hémophile ne soit pas le meilleur pour étudier le rôle des mannosylations du FVIII sur son immunogénicité. Pour cette raison, nous proposons d¿utiliser également le modèle des chiens déficitaires en FVIII.
En parallèle, les pharmaco-cinétiques des variants seront comparées in vivo. Des récepteurs pour les sucres mannosylés sont exprimés sur de nombreux types de cellules `éboueuses¿. Nous espérons que les variants démannosylés du FVIII auront une demi-vie prolongée dans la circulation. Ainsi, un échec à générer une molécule de FVIII moins immunogène sera peut-être compensé par la génération d¿un FVIII à demi-vie prolongée.
//Une demande de brevet a été déposée en France, le 22 décembre 2005 sous le n°05 13120. Son titre est ¿Inhibition de la réponse immunitaire anti-FVIII¿. Ce brevet est co-déposé par l¿INSERM, le LFB et les co-inventeurs sont S Lacroix-Desmazes, J Bayry, S Dasgupta, SV Kaveri et S Chtourou. L¿invention concerne un composé capable d¿inhiber l¿endocytose du FVIII par les cellules du système immunitaire capables d¿endocyter l¿antigène, et l¿utilisation thérapeutique d¿un tel composé pour la fabrication d¿un médicament destiné au traitement des hémophiles pour diminuer l¿immunogénicité du FVIII et/ou augmenter la demi-vie du FVIII. L¿une des revendications (#8) protège un composé s¿agissant d¿un FVIII modifié ou d¿un fragment de celui-ci dont l¿endocytose par les cellules capables d¿endocyter l¿antigène est diminuée par rapport au FVIII natif.