– MS4MeP

1-Contexte scientifique et objectifs du projet : Les protéines membranaires (PMs ; un tiers des protéines exprimées) assurent la communication entre cellules et entre compartiments cellulaires et sont à ce titre, acteurs de nombreuses voies de transduction du signal. Aujourd'hui, elles sont la cible d'environ 60% des médicaments et sont impliquées dans des pathologies aussi diverses que le cancer, le diabète, l'épilepsie, ou encore les dysfonctionnements neurologiques ou endocrinologiques. Caractériser leurs interactions et déterminer leurs structures sont donc des enjeux très importants et représentent un challenge pour les années à venir. Pourtant, malgré leur rôle prépondérant dans de nombreuses fonctions biologiques, la grande majorité d'entre elles sont encore mal caractérisées. De part leur caractère amphipathique (semi hydrosoluble/semi liposoluble), elles constituent une famille de protéines extrêmement difficile à étudier et les analyses structurales bloquent souvent sur l'une ou l'autre des deux étapes suivantes : la surproduction sous forme fonctionnelle et l'obtention de cristaux analysables par diffraction aux rayons X. Se pose alors rapidement le problème du contrôle qualité. C'est dans ce cadre très général que se situe notre projet qui a pour but de mettre au point une méthode de caractérisation détaillée de ces protéines membranaires et de leurs partenaires d'interaction. Pour cela, nous proposons d'utiliser une approche basée sur la spectrométrie de masse (SM) dont les développements récents ont littéralement révolutionné la microanalyse des protéines en permettant d'accéder, avec rapidité et sensibilité, à l'identification de mutations et à la détermination des modifications post-traductionnelles. De nombreuses approches dites protéomiques (c'est-à-dire visant à l'étude de l'ensemble des protéines codées par un génome) sont aujourd'hui disponibles et sont utilisées tant au niveau d'études fondamentales qu'au niveau d'études appliquées. Toutefois, la plupart des protocoles décrits dans la littérature ont été établis sur des extraits protéiques solubles qui ne peuvent être transférés intacts sur des extraits protéiques membranaires. - 2-Description du projet, méthodologie : - Notre projet vise à mettre au point une méthode de caractérisation fine des protéines membranaires (PMs) et de leurs partenaires d'interaction, basée sur l'utilisation de la spectrométrie de masse. A l'aide d'un système modèle, les Récepteurs Couplés aux Protéines G (RCPGs), nous souhaitons développer des protocoles compatibles avec le caractère amphipathique des PMs en nous focalisant sur l'obtention d'un recouvrement de séquence maximal, nécessaire à la mise en évidence de modifications post-traductionnelles ou d'isoformes. Développées puis validées sur des systèmes recombinants purifiés, ces méthodes seront ensuite appliquées à des systèmes plus complexes mettant en jeu les RCPGs et plusieurs partenaires d'interaction. Ce projet associe un laboratoire impliqué dans les domaines de l'expression, de la purification et de la cristallisation des protéines membranaires, notamment des RCPGs et un laboratoire de spectrométrie de masse spécialisé dans la caractérisation des protéines et dans l'étude dynamique de complexes multiprotéiques. Le premier laboratoire a développé une importante plateforme d'expression lui permettant de disposer d'une vaste collection de PMs recombinantes, et a validé des procédures de production et de purification permettant d' amener certaines d'entre elles à l'étape de cristallisation. Cependant, lorsque cette dernière n'aboutit pas, un besoin en données analytiques sur la pureté et l'homogénéité est cruellement requis. Dans ce contexte, la SM s'avérera une aide précieuse dès lors que la technologie saura s'adapter au caractère hydrophobe des PMs. La mise en commun des savoirs-faires et des expertises de ces deux laboratoires s'est déjà avérée fructueuse sur l'étude d'un transporteur bactérien (FpvA) et les résul