Phénomène de priming dans les dyskinésies dopa-induites et la dérégulation du trafic des récepteurs – TRAFinLID

Les dyskinésies L-dopa-induites (DLI) limitent son utilisation dans la maladie de Parkinson (MP). Nous souhaitons étudier la physiopathologie du phénomène de « priming », c'est à dire les modifications irréversibles de réponse du cerveau à la dopamine (DA) qui conduisent au développement de dyskinésies. Nous étudierons le rôle de la désensibilisation homologue des récepteurs à protéines G et ses conséquences sur les deux principales cascades de signalisation intracellulaire, la voie canonique et la voie des « mitogen-activated protein kinase cascade (MAPK)' via l'activation de différents « scaffolds ». Ces études seront menées chez trois modèles: un modèle de tranche cérébrale nigrostriatale en culture, un modèle rat de mouvements anormaux involontaires et un modèle primate de DLI. Suite à l'élucidation des aspects physiopathologiques, nous développerons des approches expérimentales de prévention du « priming » utilisant la technologie de transfert de gènes par vecteurs lentiviraux.//Un tableau « Gantt » illustre la gestion scientifique, technique et économique du projet. Chaque question spécifique (QS) est scindée en différentes tâches et objectifs. Les techniques sont toutes validées par des publications.
QS1 (Mois 1-48): Fourniture du modèle de tranche nigrostriatale en culture et des 2 modèles expérimentaux in vivo chez le rat et le primate pour les autres QSs.
QS2 (Mois 1-24): Cinétique du trafic intracellulaire des récepteurs DA et mGluR ainsi que de la machinerie de la désensibilisation homologue (GRK/arrestine) dans des cultures/cerveaux déplétés en DA jamais traités par un dopamimétique (immunohistochimie à microscopie optique, déconvolution de fluorescence, électronique à fractionnement subcellulaire).
QS3 (Mois 4-24): Cinétique d activation de la voie canonique de signalisation au cours du priming et définition du pattern d'expression génique induit (biochimie - western blotting - hybridation in situ - qPCR suite à microdissection laser)
QS4 (Mois 12-36): Cinétique d'activation de la voie MAPK au cours du priming et étude de leur localisation subcellulaire avec leurs scaffolds. Pattern d'activation et définition du phénotype neuronal impliqué (techniques comparables à ci-dessus + double/triple marquage en immunohistochimie).
QS5 (Mois 24-48): Manipulation de l'expression des GRK en utilisant des vecteurs lentiviraux exprimant soit les GRKs (surexpression) soit des RNAi des GRKS (diminution d'expression): étude in vitro (culture) et in vivo (macaque). Etude comportementale chez le macaque suivie de l'étude des effets sur le trafic des récepteurs de l'activation des cascades de signalisation (canonique vs. MAPK). La question centrale sera : Est ce que la régulation de l'expression des GRKs peut prévenir le développement des dyskinésies dopa-induites ? Les vecteurs viraux seront fournis par le Dr. E. Gurevich (USA) (techniques identiques+ chirurgie stéréotaxique chez le primate, étude préclinique complète, estimation de l'innocuité).
//Le projet est conçu comme la validation conceptuelle et expérimentale d'une stratégie thérapeutique visant à prévenir le priming. Les besoins cliniques sont énormes, la L-dopa restant la drogue de référence. A ce jour, le rôle du trafic subcellulaire des GPCRs dans de telles conditions expérimentales in vivo est inconnu puisque les données disponibles on été collectées in vitro. Le même constat s`applique aux cinétiques d'activation des cascades de signalisation canoniques et non-canoniques. Si nous démontrons, sur la base d'une démonstration complète et structurée tant in vitro qu'in vivo, que la manipulation de l'expression de GR2 où de GRK6 permet de prévenir le développement des dyskinésies dans le modèle macaque, notre projet ouvrira de nouvelles voies de traitement des dyskinésies, soit via la thérapie génique (vecteurs lentiviraux déjà testés cliniquement) soit via la modulation pharmacologique d'acteurs clés tels que les MAPK.