Imagerie confocale quantifiée : reconstruction 3D automatique à partir d¿images en micro rotation – NIN-AL cell viewer

En microscopie de fluorescence, l'imagerie 3D individuelle de cellules vivantes est un outil essentiel en biologie. Aujourd'hui, une contrainte critique des techniques existantes est que l'échantillon doit être fixé sur une surface transparente interdisant de fait leur utilisation pour des cellules non adhérentes. La sévérité de cette limitation devient apparente quand on sait que pour la recherche biologique et les applications essais et diagnostics, certaines des cibles les plus importantes sont les cellules non adhérentes (cellules souches, cellules cancéreuses, lymphocytes). Nous proposons donc un système d'imagerie 3D dédié aux cellules vivantes non adhérentes. Le cœur technologique de ce système combine un matériel propriétaire pour la manipulation de cellules en suspension avec un logiciel d'imagerie dynamique 3D. C'est une nouvelle technologie d'imagerie permettant la reconstruction microscopique 3D quantifiée et sans intervention manuelle, comme jamais réalisée jusqu'à présent.
Notre microscope confocal est équipé d'une cage diélectrique dans laquelle des cellules en suspension peuvent être piégées et manipulées. Une fois qu'une cellule individuelle a été piégée, nous réglons le champ électrique afin que la cellule tourne sur elle même. Pendant cette rotation continue, une séquence d'images est acquise. Parmi les avantages de cette technique, outre le fait de voir une cellule non-adhérente sous différents angles de vue sans avoir à la manipuler, est la possibilité de remédier au problème de l'anisotropie de la résolution microscopique : la résolution perpendiculaire au plan focal est deux moindre que celle dans le plan focal. Analyser une telle séquence d'images 2D pour en inférer des structures 3D est extrêmement difficile et souvent impossible. Il est nécessaire d'avoir une visualisation vraiment 3D permettant la quantification et la mesure. Récemment une tentative a été proposée utilisant un petit nombre de rotations (2 ou 3) mais seulement de type axiale. Ceci ne permet pas de résoudre le problème de l'anisotropie. Nous avons développé un protocole d'acquisition et une nouvelle méthode de tomographie mathématique pour l'imagerie confocale 3D de micro rotation. D'un point de vue mathématique, nous avons résolu le problème de la reconstruction d'un objet à partir de coupes 2D dont les positions dans l'espace ne sont pas connues. Aujourd'hui, la phase de recherche a été réalisée et de nombreuses reconstructions ont été réalisées par l'Institut Pasteur et l'ENS sur différents types de cellules. Le but du projet ANR est de finaliser un système prototype, prêt à être utilisé en routine.
L'objet principal de ce travail est divisé en trois objectifs principaux :
1- Evaluation de la reconstruction 3D de la cellule : les protocoles d'acquisition d'images en micro-rotation et les paramètres du logiciel seront optimisés par des essais d'aller-retour. Ceci permettra d'établir un ensemble de protocoles adaptés à différents types de cellule (lymphocytes, cellules sanguines, neutrophiles) et de régler les paramètres clefs du logiciel afin d'obtenir des procédures complètement automatiques.
2- Retour sur le code : l'évaluation guidera l'ajustement du code du logiciel. Cette tache améliorera la capacité des algorithmes de fournir des solutions pour une large variétés de données de micro-rotation.
3- Intégration du code et optimisation : le code qui a été élaboré pendant la phase de recherche sera ici partiellement réécrit et optimisé afin de réduire les temps de calcul et ouvrir des possibilités d'utilisation pour la recherche de caractéristiques cellulaires 3D en criblage.