Prevention des Conflits Transcriptionnels – PrTxConf

La transcription d’un gène est un processus fortement régulé qui obtient un « feu vert » lors d’une phase d’initiation, puis procède par une phase de transcription active extrêmement processive, pour enfin s’arrêter brusquement lors de la phase de terminaison de transcription. De façon générale, la terminaison de transcription implique l’immobilisation de l’ARN polymérase (ARNp) sur l’ADN, et, à partir de cet état immobilisé, la dissociation de l’ARN puis de la polymérase de l’ADN. Si la transcription par l’ARNp n’est pas correctement terminée, la grande stabilité de l’ARNp sur l’ADN permet à la polymérase de poursuivre son travail de transcription sur de grandes distances. Ceci pose un risque d’interférence avec des processus génomiques se déroulant sur les séquences d’ADN situées en aval de l’endroit où devait se terminer la transcription. Ainsi par exemple chez les êtres humains l’enzyme connue sous le nom de « senataxine » est essentielle à la terminaison de la transcription dite « cryptique » ou « antisens », et les dysfonctionnements de cette enzyme sont liés à des défauts de développement du cerveau. Aujourd’hui encore, l’analyse des propriétés cinétiques et structurelles d’ARNp immobilisée ou en cours de terminaison reste particulièrement difficile car ces états et leurs intermédiaires sont typiquement transitoires et difficiles à synchroniser.

Dans ce projet nous emploierons des méthodes innovantes permettant d’observer et manipuler des molécules individuelles de protéine et d’ADN afin de contourner la grande difficulté que pose la synchronisation d’un échantillon comportant un grand nombre de molécules. Ces méthodes incluent la cryo-microscopie électronique (cryo-EM) ainsi que des techniques corrélatives permettant de combiner nanomanipulation de molécules individuelles et leur détection simultanée par fluorescence molécule-unique. L’emploi de ces méthodes nous permettra de répondre à d’importantes questions fondamentales et mécanistiques concernant la terminaison de transcription. D’un côté, la nature complémentaire des méthodes employées nous permettront d’analyser à la fois les propriétés structurelles et les propriétés cinétiques de polymérases immobilisées ou en cours de terminaison, établissant les liens entre structure et fonction lors de la terminaison de transcription.

Nous nous intéresserons ainsi aux changements conformationnels prenant place au sein même de l’ARN polymérase lors de la terminaison de transcription, et en particulier à l’ouverture et la fermeture des « pinces » de la polymérase qui lui permettent de fortement s’agripper à l’ADN. Nous analyserons également l’effet de facteurs de transcription qui permettent le redémarrage d’une polymérase immobilisée de façon précoce sur son ADN. L’interaction de ces facteurs de transcription avec l’ARNp est extrêmement dynamique, expliquant la difficulté à étudier ces interactions par les méthodes structurelles classiques telle la cristallographie aux rayons X. La cryo-EM permettra de séparer les ARNp seules des ARNp interagissant avec les facteurs de transcription, nous permettant de déterminer la base structurelle de ces interactions. Finalement, ce projet s’intéressera également aux processus de terminaison extrinsèque de la transcription, responsables de la régulation de la transcription dite « cryptique » ou « antisens ». La terminaison extrinsèque fait intervenir des interactions entre hélicases et polymérases, soulignant une fois de plus la nature dynamique de ces interactions et le besoin de méthodes résolues dans le temps pour les étudier.