Virus ARN et maladies inflammatoires cardiaques chez l’homme: de la métagénomique virale au modèle animal – HeartVir

Au cours des dix dernières années, les techniques de métagénomique qui reposent sur le séquençage massif d’un ensemble de génomes sans à priori initial sur la séquence ou l’agent ciblé, se sont imposées comme un outil puissant dans la découverte des nouveaux virus dans le domaine médical. Dans le cadre de ce projet, nous utilisons une approche de métagénomique à grande échelle afin de rechercher et de caractériser les virus associés à des myopéricardites idiopathiques. Une fois ces virus identifiés et que leur présence a été validée dans l’échantillon initial, nous étudions leur prévalence sérologique et moléculaire à travers une étude épidémiologique exhaustive sur une cohorte de patients atteints de myopéricardites idiopathiques au cours des trois dernières années. Un effort collectif est en outre porté sur l’isolement de ces virus par culture en se basant sur les récents travaux publiés dans le domaine afin de produire du virion en quantité suffisante pour pouvoir générer un modèle animal dans le but de mieux mieux comprendre la physiopathologie de l’infection.

La première étape de ce projet a consisté en en la mise au point, validation et publication d'un protocole robuste permettant de purifier des particules virales qui restent infectieuses (ce qui est nécessaire pour des essais ultérieurs d'isolement et de production par culture cellulaire) tout en limitant la contamination par les acides nucléiques de l'hôte en vue du séquençage (Temmam S. et al., 2015). Ce protocole a été appliqué à des échantillons de liquides péricardiques et a permis de découvrir un nouveau gemycircularvirus chez un jeune patient (14 ans) présentant une récidive de péricardite (Halary S. et al., 2016). Une étude de la prévalence moléculaire et sérologique de ce virus chez des patients atteints de (myo)-péricardites est en cours ainsi que des tentatives de mise en culture sur différents supports permettant une production suffisante pour étudier la physiopathologie de cette infection virale dans un modèle animal.
En fonction du type et des conditions de préservation des échantillons, une proportion élevée de séquences humaines contaminantes a été observée dans certains métagénomes. Nous avons ainsi développé une approche reposant sur l'hybridation soustractive par capture avec un complexe biotine/streptavidine des acides nucléiques humains de l'échantillon extrait. Ce protocole, en cours de valorisation, a été appliqué avec succès à des échantillons de sang de patient atteints de myocardite aigue. Une approche bioinformatique reposant sur réseaux de similarités appliquée aux virus (Halary S. et al., 2016) nous a permis de détecter des séquences de nouveaux rétrovirus et/ou rétrotransposons dont le rôle est en cours d'analyse. Enfin, nous avons utilisé un protocole adapté aux tissus (Temmam S. et al., 2016) pour traiter les valves cardiaques de 12 patients atteints d'endocardites à hémoculture stérile et les résultats de séquençage sont en cours d'analyse.

D’un point de vue scientifique, ce projet apportera des informations capitales sur les causes des myopéricardites et des connaissances approfondies sur l’épidémiologie et la physiopathologie de l’infection, connaissances qui ouvriront à leur tour de nouvelles perspectives thérapeutiques. D’un point de vue technique, ce projet repose sur les dernières innovations en matière d’obtention d’acides nucléiques viraux purifiés, de séquençage haut-débit et d’analyses de séquence. Le protocole développé au sein de ce projet pourra ainsi être transposé plus généralement à d’autres pathologies pour la recherche de virus ARN et ADN (et notamment dans le cadre des maladies virales émergentes). Enfin, de nombreuses retombées socio-économiques peuvent découler de ce projet. La myopéricardite aigue étant à la fois une maladie potentiellement mortelle et évoluant fréquemment en forme récidivante voire chronique, son cout économique à l’échelle de la société est significatif. A travers une meilleure connaissance à la fois des agents étiologiques responsables de myopéricardites et de la physiopathologie de l’infection, les résultats de ce projet aideront les équipes médicales à définir la meilleure prise en charge possible et la stratégie thérapeutique la plus adaptée à un patient donné. Ceci aura pour conséquence une amélioration du pronostic et ainsi une réduction des coûts médicaux.

1. Temmam S., Monteil-Bouchard S., Robert C., Pascalis H., Blanc-Tailleur C., Jardot P., Charrel R., Raoult D., and Desnues C. (2015) Host-associated metagenomics: a guide to generate infectious RNA viromes. PLoS One 2;10(10):e0139810
Cet article décrit un protocole permettant de générer des viromes tout en conservant l'infectivité des particules virales.

2. Temmam S., Davoust B., Chaber A.L., Lignereux Y., Michelle C., Monteil-Bouchard S., Raoult D. and Desnues C. (2016) Screening for viral pathogens in African simian bushmeat seized at a French airport. Transb. Emerging Dis. doi: 10.1111/tbed.12481.
Cet article propose un protocole rigoureux permettant de purifier des particules virales à partir de tissus. Ce protocole a été utilisé pour les valves cardiaques et sera utilisé pour les biopsies myocardiques.

3. Halary S., Temmam S. and Desnues C. (2016) Viral metagenomics: are we missing the giants? Current Op. Microb. 31:34-43. doi: 10.1016/j.mib
Cet article propose une approche basée sur les réseaux de similarités appliquée aux virus pour détecter des virus divergents dans des jeux de données de métagénomique.

4. Halary S., Duraisamy R., Fancello L., Monteil-Bouchard S., Jardot P., Biagini P., Gouriet F., Raoult D. and Desnues C. (2016) Novel ssDNA circular viruses in pericardial fluid of patient with recurrent pericarditis. Emerg. Infect. Dis. 22(10):1839-41
Cet article décrit la découverte d'un nouveau gémycircularvirus chez un jeune patient atteint d'une récidive de péricardite.

Le projet HeartVir a pour objectif principal d’approfondir nos connaissances actuelles sur les causes de maladies cardiaques inflammatoires, les agents viraux impliqués et les mécanismes physiopathologiques de l’infection en combinant des outils de séquençage haut-débit, des expériences de culture cellulaire et des études épidémiologiques. Au sein des maladies cardiaques inflammatoires du cœur, nous nous intéresserons plus spécifiquement aux péricardites et aux myocardites qui sont souvent associées et respectivement caractérisées par une inflammation du péricarde et du myocarde. Les manifestations cliniques de la myopéricardite sont variables et peuvent se présenter sous forme aigue ou chronique, asymptomatique ou très sévère mettant dans certains cas en péril le pronostic vital du patient. Parmi les agents infectieux responsables de myopéricardites identifiés à ce jour, les virus (en mono ou en coinfections) sont majoritaires. Cependant, dans plus de 50% des cas les myopéricardites restent classées comme idiopathiques ce qui signifie que malgré le prodrome viral et l’armada de tests diagnostic mise en place, l’agent étiologique n’est pas identifié. Les tests diagnostic utilisés actuellement en routine permettent uniquement de détecter des virus connus pour la pathologie et s'avèrent souvent inefficaces concernant la découverte de nouveaux agents viraux. Ceci s’explique principalement par la difficulté à isoler certains virus en culture cellulaire classique et par l’absence de gènes conservés entre les différents génomes viraux qui pourraient être ciblés par réaction de polymérisation en chaine (PCR).

Au cours des dix dernières années, les techniques de métagénomique qui reposent sur le séquençage massif d’un ensemble de génomes sans à priori initial sur la séquence ou l’agent ciblé, se sont imposées comme un outil puissant dans la découverte des nouveaux virus. Dans le cadre de ce projet, nous proposons d’utiliser une approche de métagénomique à grande échelle afin de rechercher et de caractériser les virus ARN associés à des myopéricardites idiopathiques. Une fois ces virus identifiés et leur présence validée dans l’échantillon initial, nous étudierons leur prévalence à travers une étude épidémiologique exhaustive sur une cohorte de patients atteints de myopéricardites idiopathiques au cours des trois dernières années. Un effort collectif sera en outre porté sur l’isolement de ces virus par culture en se basant sur les récents travaux publiés dans le domaine et dans le but (i) de produire des anticorps qui seront utilisés rétrospectivement dans l’études épidémiologiques rétrospective et prospective et (ii) de générer un modèle murin afin de mieux comprendre la pathophysiologie de l’infection. Le projet HeartVir réunit une jeune équipe solide et complémentaire constituée de scientifiques et médecins, experts dans les domaines de la virologie, métagénomique virale, cardiologie et maladies infectieuses et poussés par un objectif commun à savoir une meilleure connaissance des maladies cardiaques inflammatoires.