Activation des récepteurs couplés aux protéines G du glutamate : étude sur molécules uniques – NanoGluR

La famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représente plus de 30% de toutes les cibles thérapeutiques et les compagnies pharmaceutiques et de biotechnologies développent donc de nombreux programmes visant à identifier de nouveaux modulateurs pour ces récepteurs. Les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluR) sont des RCPG activés par le glutamate, le principal neurotransmetteur du système nerveux central. Pour cela, les mGluR sont des cibles particulièrement intéressantes pour le traitement d’un grand nombre d’affections neurologiques et psychiatriques (épilepsie, anxiété, dépression, migraine, spasticité, douleur, et maladie de Parkinson). Cependant, en dépit d’intenses recherches et d’essais cliniques encourageants, aucun médicament ciblant les mGluR n’est actuellement sur le marché. Une meilleure compréhension de la structure et de la dynamique conformationnelle des mGluR permettrait de mieux comprendre le mode d’action des drogues, et ainsi ouvrir la voie à de nouveaux composés thérapeutiques. Les mGluR sont des protéines multidomaines de 250kDa constituant des homodiméres stabilisés par un pont disulfure. Cette structure multidomaine offre de nombreuses possibilités de ciblage : (i) ligand orthostériques, qui ciblent le site de liaison du glutamate, situé dans le domaine extracellulaire (ECD) ; (ii) ligands allostériques, qui se lient dans la région à 7 hélices transmembranaires (7TM) commune à tous les RCPG, et responsable de l’activation des protéines G ; (iii) biomolécules (anticorps tels que les « nanobodies »). Dans le but de comprendre les bases moléculaires de l’activité des ligands des mGluR (petites molécules ou anticorps), nous proposons ici d’étudier au niveau structural : (i) le mécanisme d’action des agonistes partiels au niveau de l’ECD (ii) le mécanisme d’action des modulateurs allostériques ; (iii) le potentiel thérapeutique des anticorps de lama (nanobodies). Pour cela, nous proposons pour la première fois d’associer des approches innovantes de biochimie préparative et de fluorescence de molécules uniques (durées de vie, polarisation, et FRET).
Bien que les techniques classiques de biologie structurale (cristallographie par rayons X, résonnance magnétiques nucléaire) ont permis l’obtention de données structurales à haute résolution sur les RCPG, ces approches ne sont pas adaptées pour l’ étude mécanistique de complexes biomoléculaires multidomaines, dynamiques, et de grande taille tels que les RCPG de classe C. En revanche, la fluorescence de molécules uniques ne nécessite que de très petites quantités de matériel, et permet d’explorer variabilité et dynamique conformationelle, en s’affranchissant des effets de moyennage inhérents aux techniques d’ensemble.
L’ensemble des approches proposées ici nous permettra de mesurer la dynamique conformationnelle des mGluR en termes de distance (à l’échelle de l’angström), et en termes d’échelles de temps (de la nanoseconde à la seconde). Notre projet comporte 5 grandes étapes : (i) la purification de mGluR fonctionnels ; (ii) leur reconstitution en nanodisques de phospholipides, mimant la membrane native ; (iii) leur marquage site-spécifique par des fluorophores compatibles avec les mesures sur molécules uniques ; (iv) la mesure des changements structuraux lors de la liaison de ligands, par smFRET ; (v) la mesure cinétique de ces changements. Nous allons utiliser comme modèles mGluR2 et mGluR5, qui possèdent chacun différentes classe d’agonistes partiels, de modulateurs allostériques, et d’anticorps, bien caractérisés. Ce programme sera conduit par deux partenaires : 1/ Le groupe de P. Rondard (Institut de Génomique Fonctionelle, Montpellier), pour la purification, la reconstitution, et la pharmacologie des mGluR ; 2/ Le groupe de E. Margeat (Centre de Biochimie Structurale, Montpellier), pour le marquage et les mesures de fluorescence sur molécules uniques.