Nouvelles voies de protéolyse chez les Archées – ARCHELYSE

Le complexe de PAN est un édifice moléculaire très dynamique et réfractaire à la cristallographie aux rayons X. Différents types de complexes de PAN et de protéines partenaire présomptives, tels que des enzymes deubiquitinase, provenant de différentes souches d'archées abyssales seront exprimés dans E. coli et purifiées. Des protocoles seront élaborés pour obtenir des préparations monodisperses et stables. Des dosages d'activités unfoldases et des expériences Biacore seront développés pour étudier la dynamique du système. Des fragments de protéines seront également être purifiés pour la cristallographie. On utilisera une approche de biologie structurale intégrée combinant diffusion aux petits angles des rayons X (SAXS), cryo-microscopie électronique et cristallographie pour obtenir un des modèles pseudo-atomique de la structure de PAN. Les changements conformationnels associés à l'hydrolyse de l'ATP, à la liaison au substrat ou au proteasome seront également déterminés. Cette étude représente une preuve de concept pour le développement d'une technique innovantes de diffusion aux petits angles de neutrons (SANS) pour étudier études en temps réel le processus des machines «unfoldases«. Dans ce projet, nous allons également utiliser le complexe de PAN assemblé comme appât dans des expériences de «Pull down et de co-immunoprécipitation visant à découvrir les composantes du complexe 19 primitif chez les archées. Les protéines identifiées sont purifiées et leur interaction physique et fonctionnelle avec le complexe de PAN seront testés in vitro. Leurs fonctions seront déterminées et leurs structures seront résolues de la même manière que pour les grands complexes peptidases que nous avons identifiés dans les protéomes archées. Parmi eux, des aminopeptidases paternaires du protéasome ont déjà été identifiés. Leurs spécificités de substrat et régulation fonctionnelle seront étudiées afin de préciser leur rôle dans la dégradation des protéines.

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Appolaire A, Dura MA, Ferruit M, Andrieu JP, Godfroy A, Gribaldo S and Franzetti B. The TET2 and TET3 aminopeptidases from Pyrococcus horikoshii form a hetero-subunit peptidasome with enhanced peptide destruction properties. Mol. Microbiol. (2014) doi : 10.1111/mmi.12775.
Appolaire A, Girard E, Colombo M, Durá MA, Moulin M, Härtlein M, Franzetti B and Gabel F. Small angle neutron scattering reveals the assembling mode and oligomeric architecture of TET, a large, dodecameric aminopeptidase. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. D70 (2014) doi:10.1107/S1399004714018446.
Appolaire A, Rosenbaum E, Dura MA, Colombo M, Marty V, Noirclerc Savoye M, Godfroy A, Schoehn G, Girard E, Gabel F and Franzetti B. Pyrococcus horikoshii TET2 peptidase assembling process and associated functional regulation. Journal of Biological Chemistry (2013) 288(31) : 22542-22554

La destruction ciblée des protéines régule directement de nombreuses fonctions biologiques et débarrasse la cellule des protéines anormales. Les protéases intracellulaires sont ainsi impliquées dans les processus de réponse au stress et du vieillissement et les dérèglements de la protéolyse sont responsables de nombreuses maladies dégénératives humaines et de cancers. Le système ubiquitine-protéasome est l’acteur principal acteur de la destruction ciblée des protéines. Cependant, on ne comprend toujours pas comment l'activité du protéasome est modulée. De plus, l'existence d'autres voies de dégradation est suspectée. Le projet ARCHELYSE s’attaque à ces questions importantes en étudiant le système primitif de régulation du protéasome des Archaea. Ces microorganismes constituent un domaine séparé du vivant avec de nombreux aspects de leur biologie proche des eucaryotes, y compris la protéolyse.
Des découvertes récentes ont montré qu'un système d’adressage au protéasome de type ubiquitine existe chez les archées. Toutefois, la machinerie responsable du ciblage des protéines modifiées vers le protéasome est inconnue. Chez les eucaryotes, cette fonction est remplie par le complexe 19S. Le premier objectif du projet est de caractériser le prototype du 19S chez Pyrococcus. L'étude d'un homologue moins complexe et hyperstable, permettra de comprendre le fonctionnement du complexe 19S. Il fournira également un modèle permettant de décrire les mécanismes évolutifs sous-jacents à l'émergence du système ubiquitine-protéasome.
Chez les Archaea, le complexe PAN est un homologue de la base du complexe 19S. Nous sommes parvenu à obtenir les premières données structurales sur les complexes PANs assemblés. L'objectif est de poursuivre cet effort et de déterminer la structure de PAN, seul et en association avec HydX, une deubiquitinase putative qui représente le cœur du complexe 19S des archées. L'activité peptidase du complexe HydX-PAN sera déterminée. Les composants manquants du complexe 19S archéen seront recherchés en utilisant une méthode protéomique de « pull down » développée par le partenaire 2. Les interactants de PAN et HydX seront ainsi identifiés. Ensuite, les activités et les structures des protéines les plus pertinentes seront étudiées individuellement. Enfin, on tentera de reconstruire le complexe de régulation 19S primitif. Une combinaison des techniques de diffusion aux petits angles, de cristallographie et de microscopie électronique sera utilisée pour déterminer sa structure.
Des études in vivo ont indiqué que PAN interagi aussi avec des complexes peptidase non caractérisés. Nous avons identifié et purifié 4 peptidases géantes de structures et fonctions inconnues. Le deuxième objectif du projet est de caractériser ces machines protéolytiques. Chez les eucaryotes ainsi que chez les Archaea, des activités peptidases compensatoires ont été détecté dans les cellules traitées avec des drogues anti-protéasome. Ainsi, le projet est susceptible de révéler l'identité des peptidases responsables de nouvelles voies destruction des protéines. Ces études sont associées à des problèmes médicaux car le protéasome est une cible pharmaceutique importante. Par ailleurs, de nouvelles activités enzymatiques pourraient ainsi être brevetées
Le projet ARCHELYSE s'appuie sur les résultats solides et sur une forte expertise dans la biochimie et la biologie structurale intégrée des peptidases de grande taille. Le partenariat avec le laboratoire de microbiologie des extrêmophiles représente une grande opportunité dans le domaine. Le groupe du coordonnateur a été créé afin de développer, via l’étude de modèles extrêmophiles originaux, la diffusion aux petits angles, de nouvelles méthodes de phasage et la cristallographie à haute pression pour améliorer la détermination de la structure des grands complexes. Le projet permet de soutenir cette action et ces méthodes vont accroître nos chances de réussir dans la partie la plus difficile du projet.