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Blanc - SIMI 7 - Chimie moléculaire, organique, de coordination, catalyse et chimie biologique (Blanc SIMI 7)
Edition 2013


Ln23


Complexes de lanthanide comme nouveaux chevaux de Troie pour la détermination structurale de protéines

Ln23 ou Complexes de lanthanide comme chevaux de Troie pour la détermination structurale de protéines.
Le projet Ln23 propose d’utiliser les [Ln] ainsi que leur propriétés physiques intrinsèques comme cheval de Troie pour la détermination structurale de protéines en développant une méthodologie intégrative, efficace et utilisable pour trois techniques structurales complémentaires : la cristallographie, la diffusion aux petits angles et la RMN. L’objectif est de faire connaitre cet outil dans la communauté de la biologie structurale et de remplacer les méthodes anciennes basées sur le Sélénium.

Conception d’additif à base de lanthanide pour la cristallographie des protéines.
Conception d’additif à base de lanthanide pour la cristallographie des protéines.
L’objectif du projet est de concevoir des complexes de coordination à base de lanthanide pour la détermination de structures de protéine en utilisant trois techniques complémentaires : la diffraction des rayons X, le SAXS (Small Angle X-rays scattering) et la RMN. Pour cela il convient de trouver une famille de complexes de lanthanide (i) stables, (ii) solubles, (iii) capables d’interagir avec des protéines et (iii) luminescents, afin de tirer profit de leurs propriétés de diffusion anomale pour la diffraction et de paramagnétisme pour la RMN.
Le projet était initialement divisé en trois taches :
La Tache A est le cœur du projet : elle consiste à découvrir une famille de complexes remplissant le cahier des charges mentionné ci-dessus, à obtenir une quantité suffisante de structures de protéines modèles afin d’identifier les interactions complexe-protéine et à quantifier ces interactions en utilisant de petite molécules modèles de complexité croissante. La Tache B est méthodologique. Elle consiste à utiliser le système complexe-protéine pour plusieurs méthodes analytiques : la diffraction des rayons X bien sûr mais aussi, les techniques de diffusion (SANS et SAXS), de RMN et à tenter de comprendre voire favoriser les mécanismes de cristallisation.
La Tache C concerne les applications de cette méthodologie originale pour la détermination de structure de protéines inconnues de complexité croissante : (i) protéines inconnues d’intérêt biologique, (ii) protéines membranaires et (iii) grands assemblages protéiques.

Une approche interdisciplinaire combinant chimie de synthèse, chimie théorique et spectroscopie RMN et biocristallographie.
La méthodologie de ce projet consiste à synthétiser des complexes de lanthanide stables et solubles dans l’eau puis à tester leurs propriétés de nucléation et de phasage en présence de protéines modèles. Cette boucle a été réalisée de nombreuse fois avant de découvrir le cristallophore. Ce composé a ensuite été étudié de manière plus poussée du point de vue de ses propriétés d’interaction supramoléculaire avec les protéines en utilisant la diffraction des rayons X (synchrotron) et des approches théoriques (méthode QM-MM). En parallèle de nouvelle méthodologie d’analyse RMN des interactions Complexe/Protéine ont été mise en place notamment les titrations par DOSY paramagnétique. Cet outil est important pour comprendre le mécanisme de nucléation.
Vu les potentialités exceptionnelle du cristallophore, des collaborations nationales et internationale ont été établies pour valider nos découvertes par d’autres laboratoires. Cette étape validée, une société a été fondée pour la production et la commercialisation de ce composé.

Résultats

Le projet Ln23 a permis de découvrir un additif exceptionnel pour la cristallographie des protéines dont nous ne mesurons pas encore la portée véritable. Ce complexe de lanthanide est le meilleur additif nucléant et phasant actuellement connus et permet un gain de temps considérable s’il est utilisé en routine pour la cristallographie des protéines. Toutes les preuves de concept ont été établies lors du projet, le produit est commercialisé depuis 2017. Il ne reste plus qu’à réussir à faire en sorte que les habitudes de la communauté des cristallographes change pour faire de ce produit un nouveau standard.

Perspectives

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Productions scientifiques et brevets

1. S. Denis-Quanquin, F. Riobé, M.A. Delsuc, O. Maury, N. Giraud Chem. Eur. J. 2016, 22, 18123-18131
2. S. Engilberge, F. Riobé, S. Di Pietro, L. Lassalle, N. Coquelle, C. Arnaud, D. Madern, C. Breyton, O. Maury,* E. Girard*. Chem. Science. 2017, 8, 5909-5917.
3. B. Vögeli, S. Engilberge, E. Girard, F. Riobé, O. Maury, T. J. Erb, S. Shima, T. Wagner. PNAS 2018, 115, 3380-3385
4. S. Engilberge, F. Riobé, T. Wagner, S. Di Pietro, C. Breyton, B. Franzetti, S. Shima, E. Girard,* E. Dumont, O. Maury* Chem. Eur. J. 2018, 24, 9739-9746. r
5. Crystallophore, an efficient additive for protein crystal structure determination. IUCRj. submitted 2018.
6. I. Bernhardsgrütter, B. Vögeli, T. Wagner, P. Dominik, N. S. Cortina, G. Bange,S. Engilberger, F. Riobé, O. Maury, E. Girard, S. Shima, J. Zarzycki, T. J. Erb. Nature Chem. Biol. Submitted 2018
7. Complexe de lanthanide pour la cristallisation de protéine et la détermination de leur structure cristallographique. S. Engilberge, E. Girard, O. Maury, F. Riobé, Fr. Demande (2017), FR 3045606 A1 20170623 PCT Int. Appl. (2017), WO 2017103545 A1 20170622. Licence d’exploitation avec la société Polyvalan
8. Large scale synthesis of FR39 complex D. Pitrat, J.-C. Mulatier, S. Di Pietro, F. Riobé, E. Girard and O. Maury. Enveloppe SOLEAU ref. 557323 déposée le 28/01/2016.
9. Nouveaux complexes d’ions métalliques pour la cristallisation macromolécules biologiques et la détermination de leur structure cristallographique C. Chapelle, S. Engilberge, E. Girard, O. Maury, F. Riobé, Fr. Demande (2017) FR1770467 déposé le 06/05/2017

Partenaires

CEA/DSV/IBS COMMISSARAIT A L ENERGIE ATOMIQUE ET AUX ENERGES RENOUVELABLES

ENSL Laboratoire de chimie de l'ENS Lyon

ICMMO Institut de Chimie Moléculaire et des Matériaux d'Orsay

Aide de l'ANR 445 827 euros
Début et durée du projet scientifique janvier 2014 - 48 mois

Résumé de soumission

Le succès retentissant de la détermination complète du génome humain en 2000 a ouvert la voie à un domaine de recherche plus vaste encore : la génomique structurale qui consiste à déterminer la structure des protéines pour comprendre les relations entre leur structure et leurs fonctions. De par le nombre et la variété de protéines existantes, il s’agit d’un chantier énorme dont nous ne soupçonnons pas la portée en termes de retombées scientifiques et médicales.
Aujourd’hui, les deux outils pour cette résolution structurale sont la cristallographie et résonance magnétique nucléaire (RMN). Il s’agit de deux techniques complémentaires qui présentent des avantages et des limites : (i) la RMN permet l’analyse en solution de protéines mais requiert un enrichissement isotopique; (ii) la cristallographie permet une détermination plus rapide de structures mais reste tributaire de la préparation de cristaux de bonne qualité. Actuellement l’effort de recherche est focalisé sur le développement de très grands instruments au détriment de la recherche de nouvelles méthodologies.
Dans ce contexte, ce projet propose une méthodologie originale fondée sur les complexes de lanthanides, notés [Ln], utilisés pour leur propriétés de diffuseurs anomal permettant la résolution du problème des phases en cristallographie des protéines et pour leur propriétés d’anisotropie magnétique permettant l’émergence de la cristallographie par RMN du solide paramagnétique.
Le projet Ln23 propose d’utiliser les [Ln] ainsi que leur propriétés physiques intrinsèques comme cheval de Troie pour la détermination structurale de protéines en développant une méthodologie intégrative, efficace et utilisable pour trois techniques structurales complémentaire : la cristallographie, la diffusion aux petits angles et la RMN. L’objectif est de faire connaitre cet outil dans la communauté de la biologie structurale et de remplacer les méthodes anciennes basées sur le Sélénium. Cela permettrait un gain de temps important, une amélioration significative de la précision pour la détermination de structures de protéines et par conséquence conduirait à une utilisation optimale des grands instruments disponibles.
Le cœur du projet Ln23 a pour objectif de comprendre et quantifier les interactions supramoléculaires entre [Ln] et protéines, un domaine de recherche quasi vierge à ce jour. Pour nous envisageons de concevoir des [Ln] présentant des charges, formes, fonctionnalités variées et susceptibles de former des interactions avec des protéines, issues de la famille des malates deshydrogénase qui sont connues pour présenter une structure homogène mais des charges de surfaces très diverses. Les co-cristallisation seront réalisées en utilisant des techniques robotisées à haut débits et la formation d’adduits cristallins [Ln]–protéine sera révélée grâce aux propriétés de luminescence des éléments f. Finalement, les constantes d’affinités thermodynamiques seront déterminées sur des modèles moléculaires de complexité croissante.
En s’appuyant sur la compréhension de ces interactions il sera possible rationaliser la cristallisation entre [Ln] et protéines permettant de nouveaux développements cristallographie et en RMN du solide paramagnétiques. Il sera également possible d’éviter au contraire de telles interactions et de confiner les complexes de lanthanide dans les canaux de solvants permettant ainsi de développer des méthodes structurales à basse résolution basée sur le contraste de solvant (MASC). Les meilleurs complexes seront proposés pour collaboration à la communauté de biologie structurale et commercialisés par la société NatX-ray avec qui nous travaillons déjà.
Finalement le contrôle des interactions [Ln]-protéine et le développement de ces outils analytique permettra de s’attaquer rapidement à des problémes réels de biologie structurale comme la résolution de structures de protéines solubles inconnues, de protéines membranaires voire de grands assemblages macromoléculaires.

 

Programme ANR : Blanc - SIMI 7 - Chimie moléculaire, organique, de coordination, catalyse et chimie biologique (Blanc SIMI 7) 2013

Référence projet : ANR-13-BS07-0007

Coordinateur du projet :
Monsieur Olivier Maury (Laboratoire de chimie de l'ENS Lyon)

 

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L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.