The French National Research Agency Projects for science

Voir cette page en français

ANR funded project

Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes : Génomique, génomique fonctionnelle, bioinformatique, biologie systémique (Blanc SVSE 6)
Edition 2010


Phospho-Cav


Combining mass spectrometry and functional analyses for a comprehensive study of the phosphorylation of the Cav3.2 T-type calcium channel

Identification de nouvelles voies de modulation des canaux calciques de type T
Identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter l’épilepsie, la douleur, dépend de notre capacité à caractériser de nouvelles cibles. Les canaux calciques de type T en font partie et le challenge relevé par ce projet est d’identifier l’impact de la phosphorylation sur les propriétés fonctionnelles des canaux calciques de type T

La spectrométrie de masse est une approche innovante pour étudier la modulation des canaux
L’objectif de Phospho-Cav est l’étude de la phosphorylation des canaux calciques de type T. S’il est aujourd’hui reconnu que ces canaux T sont régulés fonctionnellement par des sérine/thréonine kinases, les modalités de cette régulation sont encore inconnues. Le challenge relevé par le projet Phospho-Cav est d’étudier la phosphorylation de Cav3.2 par une approche de spectrométrie de masse quantitative, permettant l’identification et l’analyse des résidus (sérine/thréonine) effectivement phosphorylés par des kinases modulant ces canaux.

Les trois objectifs majeurs sont :

1) d’établir une carte des résidus Ser/Thr effectivement phosphorylés du canal Cav3.2 recombinant par une approche de spectrométrie de masse ; d’étudier la spécificité et la dynamique de phosphorylation de ces résidus.

2) de caractériser l’impact de la phosphorylation de ces résidus sur les propriétés électrophysiologiques et le trafic cellulaire des canaux Cav3.2 en expression hétérologue (mutagénèse dirigée, études en patch-clamp).

3) d’identifier par spectrométrie de masse, l’état de phosphorylation des canaux Cav3.2 neuronaux (natifs) et d’évaluer l’impact de cette phosphorylation dans la différenciation neuronale et dans un modèle d’épilepsie.

Spectrométrie de masse et électrophysiologie pour l’étude des canaux calciques de type T
Le projet Phospho-Cav s’appuie sur le savoir-faire de la plateforme de protéomique de Montpellier (PPM), ainsi que sur l’expertise en électrophysiologie des canaux calciques de l’équipe du coordinateur, pour l’analyse moléculaire de la phosphorylation des canaux calciques de type T.

Results

Ce projet de recherche fondamentale en cours de développement. Aucun résultat ne peut actuellement faire l’objet d’une communication vers le grand public.

Outlook


Phospho-Cav est un projet pionnier concernant l’étude globale de la phosphorylation des canaux calciques de type T. Une perspective majeure de ce programme est une meilleure compréhension des mécanismes responsables de maladies neurologiques associées à ces canaux, en particulier l’épilepsie et la douleur.


Scientific outputs and patents

En préparation

Partners

CNRS CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE LANGUEDOC-ROUSSILLON

CNRS CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE LANGUEDOC-ROUSSILLON

ANR grant: 354 099 euros
Beginning and duration: - 36 mois

Submission abstract

Phosphorylation is probably the most important post-translational regulatory mechanism and contributes to the regulation of the voltage-gated calcium channels (Cav channels) that are involved in a wide variety of physiological “excitable” functions and disease states. Cav3/T-type channels, especially Cav3.2 channels that play important role in cell differentiation, neuronal excitability, slow wave sleep, hormone secretion and sensory processing, are also regulated by phosphorylation. Understanding how these channels are regulated is critical for the interpretation of their roles in physiology and pathophysiology (absence epilepsy, neuropathic pain and cancer). Several recent studies have highlighted that Cav3 channels, especially the Cav3.2 subtype, are modulated by a wide variety of hormones, neurotransmitters and serine/threonine protein kinase pathways. These recent studies open new avenues for the study of phosphorylation of Cav3.2 channels, especially the search for phosphorylated residues and the functional consequences. This motivates the present project.

The Cav3.2 channels, that are studied in partner 1 lab for several aspects (search for domains involved in trafficking, impact of epilepsy absence mutations, search for partners…) can be directly phosphorylated and functionally modulated by several protein kinases (PKA, PKC,…) in heterologous expression systems. Classical biochemical approaches appear to be poorly reliable for the identification of the phosphorylated residues in Cav channels. Nowadays, because of the recent development in phosphoproteomic approaches, especially in partner 2's lab, a comprehensive study of the Cav3.2 channel phosphorylation can be performed, as recently reported for other ionic channels (Kv).

The main objectives of the “Phospho-Cav” project are listed below. (1) We will set-up a mass spectrometry approach (immuno-purification and phosphopeptide analysis) in order to provide a phospho-map of the residues expected to be important for Cav3.2 regulation. This part of the project will be achieved using a hemagglutinin (HA) tagged Cav3.2 channel. (2) A SILAC (stable isotope with amino acids in cell culture) procedure will be employed to estimate if, at some sites, phosphorylation is linked to specific regulatory pathways. (3) A functional analysis of the identified Cav3.2 phospho-sites will be performed using site-directed mutagenesis followed by heterologous expression in mammalian cells (electrophysiological properties, trafficking…). (4) The efficiency of antibodies for Cav3.2 immuno-purification will be characterized in order to purify native Cav3.2 channels from i) the neuroblastoma cell line NG108-15, in which Cav3.2 channels are involved in differentiation ; ii) mouse hippocampus in a temporal lobe epilepsy model, in which Cav3.2 activity is enhanced. (5) In these latter conditions, the mass spectrometry approach will allow identification of the phosphorylation status in a physiological context (differentiation) and in a disease state (epilepsy). (6) These novel active phosphorylation sites, possibly novel splice variants, will then be studied in heterologous expression as described above (3).

Completion of this project, especially the analysis of phospho-status of Cav3.2 channels, should provide the first global analysis of the active phospho-sites of Cav3.2 channels. Studies of functional consequences of native Cav3.2 channel phosphorylation will offer the first possibility to probe how signalling pathways may be involved in the regulation of Cav3.2 protein in normal and disease states. Using this global approach, we can expect to provide a comprehensive view of the important residues involved in PKA/PKC modulation of Cav3.2 channels, as well as other PK pathways. Ultimately, such an approach should allow a better understanding of the Cav3.2 channel regulation in a variety of physiological and pathophysiological situations.

 

ANR Programme: Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes : Génomique, génomique fonctionnelle, bioinformatique, biologie systémique (Blanc SVSE 6) 2010

Project ID: ANR-10-BLAN-1601

Project coordinator:
Monsieur Philippe Lory (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE LANGUEDOC-ROUSSILLON)
philippe.lory@nulligf.cnrs.fr

 

Back to the previous page

 

The project coordinator is the author of this abstract and is therefore responsible for the content of the summary. The ANR disclaims all responsibility in connection with its content.