Imagerie super-résolue de la division bactérienne – DIVinHD

Nous avons combiné des méthodes de génétique, de biochimie, de biologie structurale et de microscopie pour étudier l'assemblage, le positionnement et l’activité enzymatique des machineries de synthèse du PG. Notre développement méthodologique le plus remarquable repose sur le marquage biorthogonal du PG, couplé à une observation en dSTORM (direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy) et à une simulation in silico. Plus précisément, nous avons incorporé des sondes cliquables dans la chaîne peptidique du PG nouvellement synthétisé et les avons conjuguées à de petits fluorophores. Les régions marquées ont été observées par dSTORM et leurs dimensions ont été mesurées pour obtenir les paramètres cinétiques de la synthèse et du remodelage du PG. Nous avons créé un modèle géométrique de l'élongation et de la division d'une cellule ovoïde, dans lequel nous avons introduit un événement de marquage pour interpréter en 3D les profils de localisation expérimentaux observés en 2D. Ce modèle, dont les paramètres sont basés sur les données expérimentales, a permis d'identifier la meilleure hypothèse concernant la dynamique de synthèse et de remodelage du PG au cours du cycle cellulaire.

L’étude publiée dans (Hosek et al., 2020) montre que la majorité du domaine cytoplasmique de la protéine MapZ, qui est un substrat de la Ser/Thr kinase StkP, est intrinsèquement désordonnée. Deux régions pourraient toutefois former des structures secondaires hélicoïdales lors de l'interaction avec la protéine majeure de division FtsZ et/ou avec les lipides de la membrane. MapZ interagit avec les filaments de FtsZ et son monomère, mais n'a pas d'effet sur la polymérisation de la protéine. Nous avons également montré une interaction entre MapZ et des liposomes, qui s’est révélée plus forte dans des conditions expérimentales mimant sa phosphorylation. Ces observations suggèrent que le recrutement et la stabilité des machineries du PG au site de division impliquent non seulement des interactions protéiques, mais également des interactions avec les lipides membranaires et la phosphorylation médiée par StkP.
Les travaux de (Jacq et al., 2018) indiquent que Pmp23 possède une activité lysozyme qui est importante pour la morphologie et la division de S. pneumoniae. Nous avons également montré que la forme active de Pmp23 est nécessaire pour la localisation de MapZ et de FtsZ, mais pas pour l’activité de synthèse du PG. Pmp23 se localise au milieu de la cellule, où elle interagit directement avec la synthase du PG PBP2x. Enfin, l'inactivation de l’activité hydrolase de Pmp23 augmente la proportion de liaisons peptidiques complexes. Ces observations soutiennent l’hypothèse dans laquelle Pmp23 dégraderait les chaînes glycanes incorrectement incorporées par PBP2x dans le réseau de PG. Non corrigées, ces «erreurs« d’incorporation conduirait à une délocalisation partielle de MapZ, FtsZ et des PBPs, qui serait rapidement accentuée par la synthèse de PG, conduisant à de graves défauts de forme. Ces travaux suggèrent donc une nouvelle fonction de «contrôle qualité« pour une hydrolase du PG.
Enfin, les méthodes et l’étude publiées dans (Trouve et al., 2021a, 2021b) ont fourni des outils et des informations sans précédent pour la synthèse et le remodelage du PG chez les ovocoques. Les données obtenues à une résolution nanométrique ont permis d’analyser l’architecture des régions cellulaires dans lesquelles le PG est assemblé et remodelé, et d’extraire des paramètres cinétiques inaccessibles avec les méthodes de microscopie classiques. Ces données expérimentales ont été exploitées in silico pour modéliser la morphogenèse d’une cellule ovoïde et tester plusieurs hypothèses concernant les activités des machineries du PG. Ce travail montre que chez le pneumocoque, les activités du divisome et de l'élongasome commencent de façon concomitante dans la région septale, mais progressent séparément au cours du cycle cellulaire, l'élongation persistant après la fin de la division. Enfin, nos données suggèrent que le PG synthétisé par le divisome est remodelé par les hydrolases du PG, qui le partitionnent, et par l’élongasome, qui insère du PG dans les régions clivées.

L'étude de Hosek et al. soutient l'idée commune selon laquelle les protéines de division précoce, telle que MapZ, dirigent l'assemblage des machineries du PG, qui comprennent les synthases et les hydrolases de la paroi (Hosek et al., 2020). Les travaux de Jacq et al. apportent un niveau de complexité supplémentaire à ce modèle en montrant qu'à son tour, l’activité enzymatique d’une hydrolase du PG peut influencer la localisation des protéines de division précoce (Jacq et al., 2018). Ces deux études suggèrent donc que l’assemblage des machineries du PG repose sur un équilibre subtil entre des mécanismes de régulation se déroulant dans le cytoplasme (comme les interactions entre MapZ, FtsZ et les lipides) et à la surface cellulaire (comme les interactions entre MapZ et le PG). L'intervention des lipides dans ces mécanismes est particulièrement intéressante, et reste un domaine largement inexploré. Le partenaire 2 a déjà identifié des protéines qui pourraient influencer la fluidité de la membrane cytoplasmique, et donc éventuellement le recrutement et/ou l'activité des synthases du PG, qui sont toutes des protéines membranaires. Le partenaire 1 par ailleurs a mis en place des méthodes de marquage fluorescent permettant de localiser les phases fluides et rigides de la membrane, ainsi que le PG nouvellement synthétisé. L'un de nos futurs objectifs sera donc d’exploiter ces différents éléments pour comprendre comment la nature et l'organisation des lipides influencent l'assemblage et l'activité des machineries de synthèse du PG.
D'autres perspectives de recherche passionnantes ont été apportées par le développement de sondes cliquables pour marquer l’activité de synthèse du PG sans perturber le processus physiologique, et par l’étude de cette activité en microscopie de fluorescence super-résolue dSTORM (Trouve, et al., 2021a, 2021b). Ce travail ouvre non seulement de nouveaux concepts concernant la synthèse du PG et la morphogenèse bactérienne, mais fournit également une nouvelle approche méthodologique qui peut être exploitée de différentes manières. Par exemple, elle peut être utilisée sur des souches bactériennes mutantes pour comprendre la fonction des protéines impliquées dans l'élongation et la division cellulaire, ou en combinaison avec des antibiotiques ciblant la voie de synthèse du PG pour comprendre leur mode d'action. Plus généralement, d'autres sondes biorthogonales spécifiques peuvent être développées pour étudier différents processus cellulaires dans tous les domaines de la vie. Par exemple, dans le cas du pneumocoque, nous nous attaquerons à l'étude combinée de la synthèse du PG et de la synthèse des acides teichoïques, l'autre composant majeur de la paroi cellulaire des bactéries à Gram positif. Le métabolisme de ces polymères de sucres complexes est également essentiel à la survie cellulaire et la dissection de sa relation avec le métabolisme du PG pourrait fournir de nouvelles pistes pour la découverte de cibles antibactériennes.

Le projet DIVinHD a mené à 4 articles de recherché publiés dans des revues à comité de lecture (Hosek et al., 2020; Jacq et al., 2018; Trouve et al., 2021a, 2021b), ainsi qu’aux communications associées, rédigées pour une large audience, à 26 communications orales, dont 16 en tant que conférenciers invités pour C. MORLOT ou C. GRANGEASSE. Au cours du projet, C. MORLOT a reçu la médaille de Bronze (2018) et C. GRANGEASSE la médaille d’Argent du CNRS (2020) pour leurs travaux sur la division bactérienne, dont une partie a été financée par ce projet ANR.

Les maladies infectieuses restent la cause prédominante de décès dans le monde. Dans ce contexte, il est paradoxal que notre connaissance de la division procaryote, qui est une source riche de cibles antibactériennes, soit moins avancée que celle de la division eucaryote.
Afin de préserver leur intégrité et leur forme au cours de la division cellulaire, les bactéries coordonnent les processus de constriction membranaire, d’expansion et de remodelage de la paroi au sein d’une machinerie protéique appelée le divisome. L’identité de la plupart des composants du divisome est connue, plusieurs interactions ont été décrites, des tests d’activité enzymatique et des structures cristallographiques sont disponibles, mais nous ne comprenons toujours pas comment ces protéines s’assemblent en un complexe macromoléculaire fonctionnel dans la cellule, ni comment l’assemblage et l’activité de ce complexe sont régulés dans le temps et dans l’espace. L’élucidation de ces mécanismes est toutefois essentielle à la compréhension du mode d’action des antibiotiques présents, à l’identification de nouvelles cibles antibactériennes et molécules inhibitrices.

L’étude de l’assemblage et de la régulation de complexes protéiques in vivo par microscopie de fluorescence est restée longtemps limitée par la diffraction de la lumière (~250 nm), qui approxime le quart du diamètre d’une cellule bactérienne (~1 µm). Au cours des dernières années, l’émergence de la microscopie super-résolue a fourni des méthodes très puissantes pour imager les structures protéiques in vivo. Le consortium DIVinHD (DIVision in High Definition) a contribué à cette importante rupture technologique en développant l’usage du 3D-SIM (Structured Illumination Microscopy, résolution d’environ 110 nm) et du PALM (PhotoActivated Localization Microscopy, résolution d’environ 20 nm) chez le pathogène humain Streptococcus pneumoniae. Ces études ont généré des données fondamentales sur i) la structure physiologique formée par la protéine du cytosquelette FtsZ, une structure annulaire (l’anneau Z) qui échafaude l’assemblage du divisome et ii) le positionnement de l’anneau Z au site de division. Le projet DIVinHD exploitera cette avancée récente pour comprendre comment le divisome s’assemble sur l’anneau Z et déterminer le rôle de la Ser/Thr kinase StkP dans cet assemblage, StkP jouant un rôle majeur dans la régulation de la division du pneumocoque. Notre consortium répondra à ces questions à travers une approche pluridisciplinaire combinant génétique, biochimie, biophysique, imagerie super-résolue et biologie structurale.

Dans des souches de S. pneumoniae de type sauvage, déficientes pour la division ou pour la fonction de phosphorylation de StkP, nous déterminerons in vivo la nano-structure PALM de FtsZ, StkP, des synthétases de la paroi PBP2x et PBP2b, ainsi que de EzrA, DivIVA et GpsB, trois protéines qui connectent l’anneau Z aux PBPs. Les PBPs étant présentes à un faible nombre de copies dans la cellule, des stratégies alternatives en dSTORM (direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy) et 3D-SIM sont proposées pour parer à d’éventuels problèmes de détection des PBPs en PALM. La dynamique de toutes ces protéines sera étudiée au cours du cycle cellulaire par FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching), pulse-chase après photoconversion, et sptPALM (single-particle tracking PALM). Les interactions entre FtsZ, EzrA, DivIVA et GpsB seront étudiées in vitro par biophysique et microscopie électronique. Nous résoudrons enfin la structure cristallographique du complexe FtsZ-EzrA, composé de deux protéines essentielles, et nous déterminerons si cette interaction est nécessaire à la survie du pneumocoque. Dans son ensemble, notre travail fournira des informations fondamentales sur les mécanismes de la division bactérienne, aidant sur le long terme au développement de nouvelles stratégies antibactériennes, en particulier par l’inhibition d’interactions protéine-protéine essentielles.