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Étude des mécanismes de défense de l’organisme (DS0408)
Edition 2015


NeuroInflamDyn


Etude de la dynamique et de la fonction de la neuroinflammation dans un modèle EAE combinant l'imagerie biphotonique et la cytométrie multiparamètrique ,

Iinterdépendance entre l’inflammation, la neurodégénération et la progression des scores cliniques dans la sclérose en plaque
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie chronique, souvent invalidante, impliquant des attaques immunitaires du cerveau et de la moelle épinière. L'objectif général de NeuroInflamDyn est d'analyser l'interdépendance de l'inflammation, de la neurodégénérescence et de la progression de la maladie.

L'objectif est de combiner l'imagerie biphotonique in vivo, la cytométrie multiparamétrique et la génétique de la souris pour caractériser la dynamique de la neuroinflammation et ses effets.
L' encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), qui récapitule les caractéristiques pathologiques de la SEP, est induite dans des souris Thy1-CFP // LysM-EGFP // CD11c-EYFP triple mutantes dans lesquelles les axones dorso-spinaux, la microglie résidente et les monocytes circulants et leur progénie fluorescent dans différentes couleurs. L'imagerie in vivo permet des études longitudinales sur le même animal pour obtenir des informations dynamiques sur des périodes allant de quelques minutes à des semaines au niveau des axones individuels, des vaisseaux et des cellules immunitaires, alors que la cytométrie multiparamétrique identifie de manière non équivoque la fréquence de sous-populations des cellules immunitaires impliquées lors des étapes critiques de la progression de la maladie, identifiées par l'imagerie. Une corrélation entre les événements cellulaires, la dégénération des axones et les scores cliniques peut être établie.
Ces données nous permettront de choisir parmi les lignées de souris créées par l'équipe 3 de manipuler des sous-populations de cellules immunitaires précises pour déterminer leur rôle dans le processus pathologique, une condition préalable fondamentale afin d'adapter des traitements efficaces ciblant les réponses cellulaires critiques. Enfin, étant donné que les effets multiples du VEGF ont été signalés sur la plasticité, la survie et la croissance des neurones, sur le recrutement des cellules myéloïdes, nous documenterons si le VEGF interfère avec l'immunité. Ceci permettra de tester si la boîte à outils unique et l'ensemble de données générées constituent une plate-forme préclinique permettant de tester et déchiffrer l'effet de thérapies au niveau cellulaire.

Combinaison de développements dans trois domaines différents, à savoir l'imagerie spectrale biphoton et de la moelle épinière, l'analyse de cytométrie de flux et la génétique de la souris
1) L'objectif est d'obtenir des chronologies précises de: l'activation de la microglie (expression CD11c-EYFP) du recrutement de cellules myéloïdes (expression LysM-EGFP) dans le parenchyme, leur répartition spatiale relative, les changements de morphologie lors de l'évolution vers une activité macrophagique dans la moelle épinière ainsi que la conséquence de leurs interactions avec les neurones (Thy-CFP).en termes de dégénérescence.
2) L'objectif est de caractériser la cascade immunitaire concomitante à l'amplification des déficits moteurs et de la phase de rémission.
Nous effectuons une cytométrie de flux multiparamétrique sur des échantillons de moelle épinière dissociés et des échantillons de sang recueillis à partir d'animaux individuels à des étapes remarquables de progression de l'EAE définies en 1. Nous corrélons dynamiquement les fréquences relatives et les phénotypes de ces cellules avec l'occurrence des biomarqueurs d'imagerie trouvés dans 1.
3) L'objectif est d'entreprendre une caractérisation fonctionnelle des sous-types DC / monocytes impliqués. en utilisant des souris reconstituées par de la moelle osseuse, qui permet de moduler uniquement les leucocytes dérivés de la moelle osseuse sans affecter la microglie résidente. Nous prenons avantage de modèles de souris innovants dans lesquels les cassettes recombinantes permettent soit un marquage cellulaire avec une protéine fluorescente, soit une ablation conditionnelle / constitutive d'un type de cellule donné pour caractériser la contribution sélective de chaque sous-type sur la progression de la maladie.
4) L'objectif est de démontrer que la méthodologie mise en place dans les objectifs 1 et 2 est adéquate pour effectuer des recherches précliniques et des tests de médicaments . Comme preuve de concept, nous rechercherons si le VEGF interfère avec l'immunité et modifie le microenvironnement immunitaire de la moelle épinière EAE.

Résultats

Dans la sclérose en plaques (SEP) et dans le modèle encéphalomyélite auto-immune expérimentale(EAE), les macrophages prédominent dans les zones démyélinisées et leurs nombres sont en corrélation avec les lésions tissulaires appellées «plaques«. Ils proviennent de la microglie résidente et des monocytes périphériques après leur infiltration dans le parenchyme. Nous avons suivi la dynamique de la réponse immunitaire innée en relation avec les dommages aux axones et les signes cliniques. Nous avons induit l'EAE dans les souris transgéniques LysM-EGFP // CD11c-EYFP // Thy1CFP et utilisé une combinaison de marqueurs en cytométrie , d'immunofluorescence et d'imagerie dynamique spectrale à deux photons in vivo, pour caractériser la distribution, la morphologie et l'activité de la microglie et des cellules dérivées des leucocytes circulants. Nous avons identifié les différente étapes d'un programme immunitaire inné avec des neutrophiles circulants et des monocytes P1 envahissant la moelle épinière à travers les méninges. Le développement des plaques suit un gradient de la partie externe de la matière blanche de la moelle vers une zone plus profonde. En revanche, l'activation microgliale. a lieu de façon indifférenciée dans la matière grise et blanche puis se concentre dans les plaques. La maturation des monocytes P1 en cellules dendritiques dérivées de monocytes P3 se produit au sein des plaques. L'apparition de ce sous-ensemble de cellules transitoires et doublement marquées par YEFP et EGFP, caractérise une stabilisation de la dégradation de l'axone et des signes cliniques et la prédominance de la microglie qui phagocyte les débris d'axones dans les plaques.

Perspectives

L'appréciation de la dynamique et des fonctions spécifiques des sous-ensembles cellulaires innés est un problème crucial dans les maladies inflammatoires du système nerveux central. Nous sommes maintenant capables, grâce au développement du FACS multiparamétrique de distinguer précisément les composants de la réponse immunitaire innée chez les souris LysM-EGFP // CD11c-EYFP // Thy1-CFP EAE induites, sur des animaux individuels et au cours du temps. Ces données ont été combinées avec des données d'imagerie en tranches et des observations récurrentes non invasives in vivo des compartiments immunitaire, neuronal et vasculaire de la moelle épinière. Cet ensemble de données multiparamétriques a révélé des profils de distributions spatiales et temporelles de différents sous-ensembles cellulaires du système immunitaire inné. Par exemple, les neutrophiles et les monocytes circulants envahissent la partie externe de la moelle épinière probablement à travers les méninges, puis se répartissent tout au long de la matière blanche en migrant e long des vaisseaux. Une partie des monocytes P1 se différencie en cellules dendritiques P3 (MoDC) dans les plaques. Cette accumulation proéminente est en corrélation avec la dégénérescence axonale dans les colonnes dorsales. En revanche, les cellules microgliales s' activent dans toute la moelle épinière avant de s'accumuler dans les plaques de façon concomittante à l'accumulation maximale des moDcs. Ces événements coïncident avec une stabilisation des signes cliniques.
Par conséquent, le suivi de la dynamique et des fonctions distinctes de ces sous-populations moDCs pourrait aider à concevoir des stratégies rationnelles pour les manipuler à des fins thérapeutiques. Cela représente nos perspectives d'avenir.

Productions scientifiques et brevets

Collaboration entre les 3 ééquipes: : Alexandre Jaouen, Céline Caravagna, Sophie Desplat-Jégo, Keith Fenrich, Hervé Luche, Genevieve Rougon, Marie Malissen & Franck Debarbieux. Dynamics and distribution of microglia and myeloid cells infiltrating the central nervous system during MOG-induced EAE (submitted)
Rougon G., Brasselet S., Debarbieux F. (in press) Advances in intravital optical imaging of the central nervous system in rodents. Brain Plasticity ISSN:2213-6304
Chrobok NL, Jaouen A, Fenrich KK, Bol JG, Wilhelmus MM, Drukarch B, Debarbieux F, van Dam AM (2016) Monocyte behaviour and tissue transglutaminase expression during experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic CX3CR1(gfp/gfp) mice. Amino Acids. 2016 Nov 9. [Epub ahead of print] ISSN: 0939-4451 ;
Caravagna C., Jaouen A., Debarbieux F., Rougon G.(2016) Innovative mouse models for Imaging neuroinflammation Current Protocols in Mouse Biology 6(2):131-47. doi: 10.1002. ISBN :978-0-470-94239-0

Partenaires

AMU_INT Aix-Marseille Université_Institut de Neurosciences de la Timone

CNRS DR12 _ CIML Centre National de la Recherche Scientifique délégation Provence et Corse _ Centre d'Immunologie de Marseille Luminy

INSERM DR PACA et CORSE_CIPHE INSERM-CNRS-AMU

Aide de l'ANR 435 061 euros
Début et durée du projet scientifique janvier 2016 - 36 mois

Résumé de soumission

Ce projet, qui réunit des neurobiologistes et des immunologistes, a pour objectif de décrire l’interdépendance entre l’inflammation, la neurodégénération et la progression des scores cliniques dans la sclérose en plaque. L’EAE, qui recapitule la pathologie, sera induite dans des souris rapportrices “multicolores” Thy1-CFP//LysM-EGFP//CD11c-EYFP. En combinant nos développements récents (1) de l’imagerie biphotonique spectrale in vivo, (2) de l’analyse en cytométrie de flux multiparamétrique et (3) génétique de la souris, nous (1) caracteriserons des marqueurs d’imagerie de la progression de la maladie, (2) décrirons l’évolution des populations de cellules immunitaires dans la moelle épinière et (3) la fonction de sous populations cellules dendritiques /monocytes impliquées, (4) explorerons les effets du VEGF sur la signature immune pour apporter la preuve de concept de l’utilité de notre méthodologie pour tester l’effet de candidats thérapeutiques.

 

Programme ANR : Étude des mécanismes de défense de l’organisme (DS0408) 2015

Référence projet : ANR-15-CE16-0009

Coordinateur du projet :
Monsieur Franck Debarbieux (Aix-Marseille Université_Institut de Neurosciences de la Timone)

 

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L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.