Visualisation et Modélisation de la Mitose Bactérienne – IBM

Nous utilisons et développons plusieurs méthode de microscopie : (i) microscopie à fluorescence rapide et à haut débit, (ii) microscopie à super résolution en molécule isolée (PALM), et (iii) microscopie à illumination structurée (3D-SIM). Ces technologies nous permettent de mesurer directement la distribution dans la cellule de la protéine motrice et des protéines centromériques, leur dynamique, et le mouvement des complexes de partition relatif à la protéine motrice.

Après 18 mois, le programme a déjà donné lieu à trois publications :
#1- Nous avons proposé un nouveau modèle d’assemblage du complexe de partition, publié dans la revue Cell Systems (http://www.cell.com/cell-systems/abstract/S2405-4712%2815%2900057-5).
La combinaison des approches de génétiques, biochimie et génome-wide avec la microscopie à super-résolution (PALM) couplée avec la modélisation physique
#2- La construction des plasmides et des souches ainsi que leur caractérisation fonctionnelle en microscopie en vue de leur utilisation future pour la validation du modèle d’assemblage du complexe de partition à donner lieu à publication (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147619X15000323).
#3- L’observation pour la première fois en 3 dimensions du positionnement des acteurs de deux systèmes modèle de ségrégation au centre du nucléoïde bactérien, ainsi que la corrélation de ce positionnement avec les zones denses de l’ADN permet une avancée majeure dans la compréhension et la modélisation du processus de ségrégation de l’ADN bactérien. Ces travaux sont publiés dans la revue Nature Communications (http://www.nature.com/ncomms/2016/160705/ncomms12107/full/ncomms12107.html).

Nous avons démontré pour la première fois que les composants des systèmes de partition sont positionnés à l'intérieur du nucléoïde bactérien. Ceci aboutit à une nouvelle vision du mécanisme de ségrégation de l'ADN, et nous développons actuellement un nouveau modèle physique permettant d'expliquer cette étape importante du cycle cellulaire bactérien.

- Sanchez et al., 2016 Cell Systems (http://www.cell.com/cell-systems/abstract/S2405-4712%2815%2900057-5).
- Diaz et al., 2016 Plasmids (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147619X15000323).
- Le Gall et al., 2016 Nature Communications (http://www.nature.com/ncomms/2016/160705/ncomms12107/full/ncomms12107.html).

La prolifération bactérienne repose sur une série de processus essentiels. Parmi ceux-ci, la ségrégation de l’ADN reste énigmatique, principalement du fait de la concomitance de l’ensemble des processus cellulaires impliqués dans la dynamique des chromosomes se déroulant dans un unique compartiment cellulaire de petite taille. Les avancées récentes réalisées grâce aux approches génétiques, biochimiques et en microscopie ont conduit à l’identification des acteurs impliqués dans le processus de ségrégation de l’ADN chez les bactéries. Cependant, le mécanisme moléculaire sous-jacent n’est pas encore compris.
Les génomes bactériens codent des systèmes de partition actifs (Par) pour assurer leur transmission au cours des générations. Les systèmes Par sont minimalistes, codant seulement trois composants nécessaires et suffisants : un centromère, une protéine de liaison au centromère et une protéine motrice. Cette dernière s'auto-organise et interagit avec le nucléoïde bactérien pour distribuer spatialement les plasmides et les chromosomes. Les limites de la résolution de la microscopie à fluorescence n’a cependant pas encore permis de faire des observations permettant de définir les étapes de la ségrégation bactériennes.
Le but de ce projet multidisciplinaire est d’utiliser et de développer les nouvelles méthodes de microscopie à fluorescence pour visualiser directement et caractériser de façon quantitative le processus de ségrégation de l’ADN à très haute résolution spatiale et temporelle. Ces mesures, en parallèle de l’utilisation de technique de séquençage à haut débit, de mutants spécifiques caractérisés in vitro et de modélisation moléculaire par des approches physiques, permettront pour la première fois de disséquer in vivo le processus de ségrégation de l’ADN.
Nous utiliserons et développerons plusieurs méthode de microscopie : (i) microscopie à fluorescence rapide et à haut débit, (ii) microscopie à super résolution en molécule isolée (PALM), et (iii) microscopie à illumination structurée (3D-SIM). Ces technologies nous permettrons de mesurer directement la distribution dans la cellule de la protéine motrice et des protéines centromériques, leur dynamique, et le mouvement des complexes de partition relatif à la protéine motrice. Ces mesures nous permettront de discriminer entre les deux modèles principaux de ségrégation de l’ADN actuellement en débat, voire de les réconcilier.
Nous travaillerons sur le système expérimental modèle qui est développé par le partenaire 1 (LMGM, Toulouse) depuis plus de quinze ans, celui du plasmide F d’E. coli, portant un système de partition représentatif. Les principales approches utilisées par l’équipe à ce jour ont été basées sur la génétique moléculaire et la biochimie des protéines. Nous allons maintenant exploiter les derniers développements en microscopie à fluorescence et en détection des molécules isolées appliqués aux bactéries pour aborder la question de la ségrégation sous différents angles. Dans ce but, nous avons établi deux collaborations avec : (i) une équipe du CNRS à Montpellier (CBS, partenaire 2) qui a développé la microscopie à super résolution sur les bactéries, et qui étudie les moteurs qui séparent l'ADN ; et (ii) une équipe de physiciens de l'Université de Montpellier 2 (LCC, partenaire 3) qui s’intéressent à la modélisation des phénomènes d’auto-assemblage et d’auto-organisation dans les systèmes biologiques. Les expériences seront réalisées au LMGM et au CBS. Le travail de modélisation sera effectué au L2C. La synergie entre ces trois groupes complémentaires apportant chacun leur compétence sera dirigée vers la compréhension d’un moteur biologique simple et autonome responsable de la ségrégation de l'ADN.