Interactions protéine-protéine et protéine-ARN au sein du complexe réplicatif du virus de la grippe de type A – RNAP-IAV

Par une approche complémentaire, pluridisciplinaire et multi-échelle combinant des études cellulaires, biochimiques, structurales et de modélisation, les deux partenaires engagés dans ce projet, ambitionnent détailler la structure, l'assemblage et le fonctionnement de la RNP, sur la base de données expérimentales portant sur la nucléoprotéine (NP) mais également sur les sous-unités de l’ARN-polymérase virale.
Les composantes majeures du projet sont la biochimie des protéines et des acides nucléiques, la biophysique, la biologie structurale (cristallographie et diffraction des rayons X, SAXS, microscopie électronique, ...) et la modélisation moléculaire.

Les résultats obtenus au cours des 18 premiers mois du projet sont:
- Spécificité de l'ARN-polymérase virale pour les extrémités conservées del'ARNv.
- Caractérisation du complexe PA-PB1-RanBP5.
- Obtention de la structure cristallographique de la nucléoprotéine du virus de la grippe de type D seule.
- Obtention et caractérisation de mutants thermosensibles (construits par substitution de nucléotides ou délétions de codons) dans le peptide de liaison de la sous-unité PA. Obtention et caractérisation des révertants correspondants.
- Etude des mutations thermosensibles sur les différentes protéines de la ribonucléoprotéine en modèle murin.
- Identification d'un peptide stabilisant assemblage NP-ARN
- Identification in silico d'un nouvel inhibiteur de la polymérase.

Pour la suite du projet, les efforts viseront à :
- détailler et valider les bases moléculaires de l'interaction entre l'hétérodimère viral PA-PB1 et la karyophérine-ß humaine RanBP5,
- comprendre la dynamique moléculaire associée à la nucléoprotéine, à son oligomérisation et à l’interaction avec l’ARN,
- détailler les bases moléculaires de l’interaction entre NP et l’ARN,
- étudier les effets de différents composés identifiés sur les composants de la RNP.
In fine, l’objectif est de combiner toutes les informations obtenues pour comprendre les mécanismes de l'assemblage et du fonctionnement de la RNP, entité essentielle de prolifération du virus de la grippe dans la cellule infectée.

Publications:
1 - Monod A, Swale C, Tarus B, Tissot A, Delmas B, Ruigrok RW, Crépin T, Slama-Schwok A (2015) Learning from structure-based drug design and new antivirals targeting the ribonucleoprotein complex for the treatment of influenza. Expert Opin Drug Discov. doi: 10.1517/17460441.2015. 1019859. PMID : 25792362

2 - Crépin T, Swale C, Monod A, Garzoni F, Chaillet M, Berger I (2015) Polyproteins in structural biology. Curr Opin Struct Biol. doi: 10.1016/j.sbi.2015.04.007. PMID : 25996897

3 - Da Costa B, Sausset A, Munier S, Ghounaris A, Naffakh N, Le Goffic R, Delmas B. (2015) Temperature-Sensitive Mutants in the Influenza A Virus RNA Polymerase: Alterations in the PA Linker Reduce Nuclear Targeting of the PB1-PA Dimer and Result in Viral Attenuation. J Virol, 89 (12):6376-90. PMID : 25855727

4 - Swale C, Monod A, Tengo L, Labaronne A, Garzoni F, Bourhis JM, Cusack S, Schoehn G, Berger I, Ruigrok RW, Crépin T (2016) Structural characterization of recombinant IAV polymerase reveals a stable complex between viral PA-PB1 heterodimer and RanBP5. Sci Rep. doi: 10.1038/srep24727. PMID : 27095520

5 - Meyer L, Sausset A, Sedano L, Da Costa B, Le Goffic R, Delmas B (2016) Codon Deletions in the Influenza A Virus PA Gene Generate Temperature-Sensitive Viruses. J Virol, 90 (7): 3684-3693. PMID : 26792748

Brevet:
1 - Extension application 20140163107 USA patent by INSERM-transfert ANTIVIRAL COMPOSITIONS DIRECTED AGAINST THE INFLUENZA VIRUS NUCLEOPROTEIN. Anny Slama-Schwok et al.

La pandémie de grippe A/H1N1 en 2009 a mis en exergue la difficulté à anticiper l’émergence d’une nouvelle souche de virus influenza qui pourrait avoir des conséquences dévastatrices en termes de santé publique à l’échelle mondiale. En dépit de nombreuses études, le mécanisme réplicatif et la façon dont le virus s’adapte à l’hôte mais également échappe au système immunitaire restent des questions non résolues. Répondre à ces questions représente un prérequis indispensable pour améliorer les vaccins, les traitements antiviraux et ainsi pouvoir protéger la population d'une nouvelle pandémie.

Le virus de la grippe A est un virus à ARN simple brin de polarité négative. Son génome se compose de huit segments formant des complexes ribonucléoprotéiques (RNP). Les RNP sont composées d'une ARN-polymérase hétérotrimérique interagissant avec les extrémités complémentaires d’un des segments d’ARNv, lui-même recouvert de multiples copies de nucléoprotéine (NP). Les structures atomiques de domaines isolés des sous-unités de l’ARN-polymérase virale et de NP ont été indépendamment résolues mais l’assemblage des sous-unités pour former un complexe biologiquement fonctionnel, leur interaction avec NP et avec l’ARNv et leur implication dans l’interaction avec les facteurs cellulaires sont encore incompris.

L'objectif du projet RNAP-IAV est d’élucider le fonctionnement de l’ARN-polymérase du virus de la grippe humain et des RNP en caractérisant les interactions protéine-protéine et protéine-ARN associées à cette architecture complexe. Avec une approche complémentaire, pluridisciplinaire et multi-échelle (cellulaire, moléculaire et atomique) combinant des études cellulaires, biochimiques, structurales et de modélisation, les 2 partenaires engagés dans ce projet, visent à combiner leur expertise pour élucider la structure et le fonctionnement de la RNP, sur la base de données expérimentales solides portant sur la nucléoprotéine mais également sur les sous-unités de l’ARN-polymérase.

Une nouvelle stratégie développée par le Partenaire-1 permet la production de l’ARN-polymérase hétérotrimérique humaine en quantité suffisante pour des études structurales (cristallographie et SAXS) et fonctionnelles, en particulier sur les bases moléculaires de la reconnaissance spécifique des ARNv par l’ARN-polymérase. Les progrès récents réalisés par le Partenaire-1 en vue de l’obtention de l’hétérodimère PA-PB1 pur sont particulièrement prometteurs pour résoudre la structure de PB1 avec et sans ARN. L’expertise du Partenaire-1 à résoudre des structures à haute résolution (5Å) en par microscopie électronique sera également extrêmement précieuse et complémentaire à l’utilisation rayons-X. Les deux partenaires ont également acquis de solides compétences pour contrôler l'état oligomérique dynamique de NP qui constitue une autre condition préalable importante pour la réalisation du projet RNAP-IAV. Dans le projet, les données structurales obtenues par le Partenaire-1 seront exploitées par le Partenaire-2 pour concevoir de nouveaux antiviraux ciblant des interactions protéine-protéine et protéine-ARN basés sur le travail en cours avec le naproxène, un médicament générique avec de nouvelles propriétés antivirales visant NP. L’outil «génétique inverse» développé par le Partenaire-2 permettra de valider les résultats sur la structure du complexe polymérasique à l'échelle cellulaire. En outre, le Partenaire-2 mettra l'accent sur le transport nucléaire des sous-unités PA-PB1 et leurs interactions spécifiques avec les importines cellulaires. Ces études seront axées sur l’utilisation de mutants thermosensibles (ts) des différentes sous-unités de l’ARN-polymérase et leurs révertants. Ces mutants permettront également de mieux appréhender l'adaptation de virus aviaires à l'hôte humain.

Des répercussions pour la conception d’antiviraux et de nouveaux vaccins vivants atténués sont clairement attendues du projet RNAP-IAV.