Trm112, un activateur de methyltransférases à l'interface entre la biogenèse du ribosome et sa fonction – TrMTases

Un des challenges de ce projet consiste à produire et à purifier des complexes transitoires enzyme/substrat (protéine-protéine ou protéine –ARN) en quantité et qualité suffisante pour des études structurales et biophysiques. Différentes techniques seront combinées selon la nature des complexes.
Afin d’étudier les rôles de Mtq2 et Bud23 dans la biogénèse des ribosomes, nous utilisons les techniques de northern blot et l’analyse de profils de polysomes. Nous utilisons également des protocoles de purification par affinité permettant de détecter des interactions transitoires suivies d’analyses en spectrométrie de masse. Nous utiliserons également les techniques de microscopie et de cryométrie en flux pour étudier le rôle de ces MTases au cours du cycle cellulaire.
Afin d’étudier la régulation du réseau d’interaction entre Trm112 et ses partenaires MTases, nous allons quantifier les ARNm et protéines correspondantes. Nous analyserons également les modifications post traductionnelles susceptibles d’affecter l’affinité des MTases pour Trm112.

Nous avons résolu la structure cristallographique du complexe Trm9-Trm112 impliqué dans la modification mcm5U des ARNt. Le mécanisme d’action de cette protéine a été élucidé grâce à des tests d’activité enzymatique in vitro et l’étude in vivo de différents mutants (Letoquart et al, Nucleic Acids Res 2015). Nous avons également étudié les mécanismes par lesquels Trm112 active la MTase Trm11 (manuscrit en révision pour Nucleic Acids Res).
Nous montrons que tous les complexes Trm112-MTase sont formés sur les mêmes bases moléculaires, expliquant pourquoi les différentes MTases peuvent entrer en compétition pour lier Trm112. Cette dernière présente une grande plasticité structurale, lui permettant d’interagir avec des MTases partageant moins de 20% d’identité de séquence.
En collaboration avec Denis Lafontaine (ULB, Charleroi), nous avons montré que WBSCR22-TRMT112 sont les homologues fonctionnels des protéines Bud23-Trm112 chez S. cerevisiae. Ce complexe est nécessaire aux réactions de maturation de l’ARN ribosomique 18S. Chez ces deux organismes, la biogénèse du ribosome nécessite seulement la présence de l’enzyme de modification, et non pas son activité enzymatique (Zorbas et al, Mol Biol Cell, 2015).

De nombreuses protéines impliquées dans la traduction fonctionnent au sein de complexes multiprotéiques. Même si l’on connait maintenant la structure cristallographique du ribosome, nous disposons encore de peu d’informations concernant l’assemblage et la fonction de ces complexes : notre travail étendra les connaissances dans ce domaine.
Une étude de l’activateur Trm112 et des methyltransférases (MTases) associées, conservées de la levure à l’homme, permettra de mieux comprendre la fonction des MTases en général, mais aussi les mécanismes de traduction, de biogenèse du ribosome et leur régulation. En effet, le rôle des modifications post-transcriptionnelles/traductionnelles est encore peu connu. On sait également que chez les métazoaires, l’expression des protéines est dépendante du tissu et du cycle cellulaire. Notre étude documentera aussi les mécanismes qui permettent de réguler ces réseaux d’interaction protéiques.
Chez l’homme, 1% du protéome est constitué de MTases SAM-dépendantes, 30% étant liées à une pathologie. La protéine Mtq2 humaine pourrait être liée au syndrome de Down. Il est aussi bien connu que des défauts de biogénèse du ribosome sont liés à des pathologies appelées ribosomopathies ou à des problèmes neurodégénératifs. WBSCR22, l’homologue humain de Bud23 a été identifié récemment comme un promoteur de métastases. Enfin, ABH8, l’orthologue de Trm9 impliqué dans la réponse aux stress génotoxiques, est très exprimé dans certains cancers humains alors qu’une baisse de son niveau empêche le développement tumoral, l’angiogenèse et le développement de métastases.
Nos résultats seront donc utiles pour de futures études concernant l’étude de ces complexes dans la cellule, la tumorogenèse et pour le développement d’approches thérapeutiques.

Conferences
1. Létoquart, J., Huvelle, H., Wacheul, L., Bourgeois, G., Zorbas, G., Graille, M., Lafontaine, DL & Heurgué-Hamard, V. 10th EMBO conference on ribosome synthesis, Brussels, Belgium, 19-23 August 2015 (poster)
2. Létoquart, J., Huvelle, H., Wacheul, L., Bourgeois, G., Zorbas, C., Nicolas, E., Graille, M., Lafontaine, DL & Heurgué-Hamard, V. How the evolutionarily conserved Bud23-Trm112 methylation complex acts during ribosome biogenesis in budding yeast and human cells ?. 10th SifrARN meeting, Toulouse, March 8-10th 2016 (poster)
3. Létoquart, J., Bourgeois, G., van tran, N., Marcoux, J., Saliou, JM., Huvelle, E., Wacheul, L., Zorbas, C., van Tilbeurgh, H., Liger, D., Cianferani, S., Lafontaine, DL., Heurgué-Hamard, V. & Graille, M Structural and functional studies of four Trm112-Methyltransferase holoenzymes modifying RNA and proteins involved in translation. 10th SifrARN meeting, Toulouse, March 8-10th 2016 (poster)
4. Létoquart, J., Bourgeois, G., van tran, N., Marcoux, J., Saliou, JM., Huvelle, E., Wacheul, L., Zorbas, C., van Tilbeurgh, H., Liger, D., Cianferani, S., Lafontaine, DL., Heurgué-Hamard, V. & Graille, M. EMBO conference “Ribosome structure and function”, Strasbourg, July 6-10th 2016 (poster)

Publications
1. Zorbas, C., Nicolas, E., Wacheul, L., Huvelle, E., Heurgué-Hamard, V & Lafontaine D.L.J. The human 18S rRNA base methyltransferases (2015) DIMT1L and WBSCR22-TRMT112 but not rRNA modification are required for ribosome biogenesis. Mol. Biol. Cell, 26, 2080-2095.
2. Létoquart, J., van Tran, N., Caroline, V., Aleksandrov, A., Lazar, N., van Tilbeurgh, H., Liger D & Graille M. (2015)Insights into molecular plasticity in protein complexes from Trm9-Trm112 tRNA modifying enzyme crystal structure. Nucleic Acids Res, 43, 10989-1002
3. Bourgeois, G.; Marcoux, J.; Saliou, JM.; Cianferani, S.; Graille, M. Activation mode of the eukaryotic m2G10 tRNA methyltransferase Trm11 by its partner protein Trm112. Nucleic Acids Res; Under revision.

La synthèse d’une protéine à partir d’une matrice d’ARN messager, plus connue sous le nom de traduction, est un processus complexe qui nécessite le ribosome, un complexe macromoléculaire constitué de protéines et d’ARN ribosomiques (ARNr), mais aussi des ARNs de transfert (ARNt) et des facteurs de traduction. Tous ces facteurs sont sujets de nombreuses modifications post-transcriptionnelles et post-traductionnelles qui modulent l’efficacité et l’exactitude des mécanismes de synthèse du ribosome ainsi que de la traduction, avec des conséquences connues sur le cycle cellulaire.
La méthylation est une des modifications les plus fréquentes des ARN et des protéines. Les effets de la méthylation sur la traduction sont parfaitement illustrés par la protéine Trm112. Cette protéine est unique de part sa nécessité pour l’activité de 4 methyltransferases (MTases) modifiant l’ARNr 18S (Bud23), les ARNt (Trm9 et Trm11), et le facteur de terminaison de la traduction eRF1 (Mtq2). Trm112 intervient donc à la fois dans la biogenèse et dans la fonction du ribosome.

Dans ce projet, nous proposons de définir le rôle central de ces complexes Trm112-MTases dans la régulation de la traduction et la biologie de la cellule en général. Nous avons pour cela défini un plan de travail coordonné, basé sur nos expertises complémentaires (génétique de la levure, biochimie, biophysique et biologie structurale). Nous proposons donc:
i) De résoudre les structures tridimensionnelles de ces quatre holoenzymes Trm112-MTase en complexe avec leurs substrats (protéine ou fragment d’ARN) afin de déterminer leurs mécanismes de catalyse et leur mode de reconnaissance du substrat
ii) D’étudier les fonctions de Trm112-Bud23 et Trm112-Mtq2 dans la biogénèse du ribosome et leurs fonctions biologiques au cours du cycle cellulaire
iii) D’étudier la régulation et la dynamique du réseau d’interaction de Trm112 au cours du cycle cellulaire et en réponse à différentes conditions de stress.

La faisabilité de ce projet s’appuie sur l’accumulation de résultats préliminaires présentés en détail dans cette demande de financement.

Ce projet apportera de nouvelles données concernant le rôle physiologique de ces complexes Trm112-MTases qui sont conservés chez les métazoaires et qui sont liés à diverses pathologies humaines.