Structure et assemblage des P-bodies – PBODYSTRUC

L’interactome de DDX6 sera identifié grâce à une purification d’affinité en tandem des complexes DDX6 à partir d’une lignée de cellules épithéliales humaines, suivie d’une analyse en masse des peptides par spectrométrie de masse. La fonction des protéines dans l’assemblage des P-bodies sera testée par des expériences de silencing comme cela a été fait précédemment pour DDX6 (Serman et al. 2007). Les P-bodies seront purifiés par centrifugation différentielle suivie d’une méthode de pointe pour purifier des particules. Leurs protéines et leurs ARN seront identifiés par spectrométrie de masse et RNAseq.
Concernant la conformation des complexes RNP, l’anisotropie de fluorescence résolue en temps sera utilisée pour déterminer l’état d’oligomérisation d’une protéine DDX6 recombinante sur l’ARN in vitro, tandis que l’homoFRET donnera cette information dans les cellules, à la fois dans le cytosol et dans les P-bodies. Ensuite, un essai en spectroscopie de corrélation de fluorescence sera mis au point pour mesurer le déroulement de l’ARN en présence de protéines in vitro. Ceci permettra de mesure l’activité hélicase de DDX6 et la contribution positive ou négative de ses partenaires. L’organisation des RNP au sein des P-bodies sera analysée par immunodétection de DDX6 et de ses partenaires en microscopie électronique, suivie d’une analyse des images obtenues avec des outils de statistique spatiales. Les informations obtenues in vitro et en microscopie électronique seront utilisées pour construire un modèle virtuel de l’organisation interne des P-bodies.

La protéine DDX6 est indispensable à l’assemblage des P-bodies humains. Ses partenaires ont été identifiés à large échelle par purification en tandem couplée à la spectrométrie de masse. L’interactome obtenu confirme la place de cette hélicase à l’interface entre dégradation des ARN et répression de la traduction dans des cellules épithéliales humaines Trois complexes majeurs ont été mis en évidence : le complexe de decapping, lié à la dégradation, un complexe « CPEB-like », lié à la répression de la traduction, et un complexe ATXN2/2L mal caractérisé. Seuls les deux premiers sont localisés dans les P-bodies, démontrant l’existence de complexes DDX6 distincts dans et hors des P- bodies. Deux nouvelles protéines clés pour l’assemblage des P-bodies ont été identifiées dans le complexe « CPEB-like », LSM14A et 4E-T (Ayache et al. 2015).
Le projet a été l’occasion de mettre au point un protocole de double immuno-marquage avec des anticorps de même espèce pour la microscopie électronique (Souquère et al. 2015).

L’identification des protéines partenaires de DDX6 constitue une ressource pour les études à venir. Dans le cadre de ce projet, elle a permis d’identifier deux autres protéines impliquées dans l’assemblage des P-bodies. Reste à savoir si les trois protéines interviennent ensemble ou séparément pour recruter les ARN dans les P-bodies.
Le protocole mis au point pour le double-immunomarquage en microscopie électronique aura des applications au-delà du projet présenté ici.

Publications dans des journaux internationaux
1. S. Souquere, D. Weil#, and G. Pierron#. 2015. Comparative ultrastructure of CRM1-Nucleolar bodies (CNoBs), Intranucleolar bodies (INBs) and hybrid PML/p62 bodies reveals a new facet of nuclear body plurality. Nucleus 6, 326-38.
2. J. Ayache*, M. Bénard*, M. Ernoult-Lange, N. Minshall, N. Standart, M. Kress, and D. Weil. 2015. P-body assembly requires DDX6 repression complexes rather than decay or Ataxin2/2L complexes. Mol Biol Cell.26, 2579-95.

Communications dans des congrès internationaux
1. 06/2015: EMBO Meeting: RNA localization and local translation (Crete) – poster
2. 07/2015: Translation UK (Aberdeen, UK) – communication orale et poster
3. 10/2015: Euronet RNP and disease (Marrakech, Maroc) – communication orale et poster
4. 10/2015: Hallmark of cancer: focus on RNA (Institut Curie, Paris) – poster

Communications dans des congrès nationaux
1. 10/2015: Colloque inaugural de l’IBPS (Paris) – poster
2. 03/2016: 10ème rencontre du SIFRARN (Toulouse) - communication orale et 2 posters

L'expression des gènes dépend non seulement de leur transcription dans le noyau, mais aussi d'événements post-transcriptionnels dans le cytoplasme : dégradation des ARNm, stockage des ARNm et traduction. Ceux-ci dépendent des protéines qui sont liées aux ARNm et de leur organisation en complexes, parfois associés à des localisations particulières dans des granules ribonucléoprotéiques découverts récemment, comme les P-bodies. Ces granules, dépourvus de membrane, contiennent des milliers d'ARNm associés à des complexes protéiques (RNP). D'après leurs composants, les P-bodies jouent un rôle dans la dégradation des ARNm, la répression de la traduction et l'interférence ARN. Pourtant, ils ne semblent pas nécessaires pour ces processus, et le rôle de cette compartimentation en granules reste flou. Néanmoins, ils sont présents chez tous les eucaryotes, animaux et végétaux, des Trypanosomes aux mammifères. Ce projet propose d'aborder la question en déterminant la composition des P-bodies, leur architecture et leur mécanisme d'assemblage.
Les P-bodies et leurs composants seront étudiés en utilisant des stratégies multi-échelles, grâce à la participation de quatre partenaires d'expertise distincte et complémentaire. La coordinatrice, Dominique Weil, étudiera les P-bodies dans leur contexte cellulaire, en utilisant des approches de biochimie, de protéomique et de transcriptomique. Eric Deprez se focalisera sur une protéine essentielle à l'assemblage des P-bodies, et étudiera la conformation des complexes qu'elle forme in vitro et in vivo avec l'ARN, par des techniques de biophotonique. Philippe Andrey générera un modèle mathématique des P-bodies, basé sur des données expérimentales de microscopie électronique obtenues par Gérard Pierron.
Une partie du projet vise à caractériser les RNP présents dans les P-bodies. La protéine à DEAD-box Rck/p54 étant essentielle pour l'assemblage des P-bodies chez les mammifères, il s'agira de caractériser ses protéines associées, pour savoir comment elle se distribue entre complexes de dégradation, de répression de la traduction, d'interférence ARN, ou autres. Nous déterminerons aussi l'importance de ces protéines pour l'assemblage des P-bodies. D'autre part, les P-bodies seront purifiés pour identifier leurs composants protéiques et ARN. Ils pourraient contenir tous les types de complexe Rck/p54 ou certains seulement, et éventuellement de nouveaux composants. Et nous saurons enfin si le ciblage des ARN dans les P-bodies est sélectif ou pas.
Une autre partie du projet consistera à caractériser les complexes [Rck/p54 – RNA] in vitro et in vivo. La liaison de Rck/p54 aux ARN défait leurs structures secondaires in vitro (unfolding). Cette conformation relaxée pourrait jouer un rôle central dans l'architecture des P-bodies. De plus, Rck/p54 tend à former des oligomères, ce qui pourrait aussi participer à l'assemblage des granules. Nous déterminerons le statut oligomérique de la protéine quand elle est liée à l'ARN, et nous étudierons son activité de "unfolding", seule ou en présence de ses partenaires principaux.
La dernière partie du projet est de chercher à comprendre l'architecture des P-bodies en modélisant un P-body avec de l'ARN et des protéines comme briques élémentaires, et en tenant compte des résultats obtenus ci-dessus. Le modèle in silico sera ajusté en utilisant des images de microscopie électronique des P-bodies dans leur contexte cellulaire, et des outils d'analyse statistique spatiale adaptés ou créés pour cette étude.
Cette étude devrait apporter de nouvelles connaissances sur l'architecture et la fonction des P-bodies, notamment sur leur contenu en ARN. Ceci est intéressant non seulement pour les P-bodies, mais aussi pour des granules apparentés présents dans des conditions particulières (granules de stress) ou dans des cellules particulières (cellules germinales, neurones).