La maturation des ARNt étudiée par RMN en cellules ou en extraits cellulaires – NMR-VitAmin

La RMN en cellules représente un nouvel outil biophysique pour étudier les modifications chimiques et structurelles des biomolécules à l'échelle atomique à l'intérieur des cellules vivantes. En effet, la RMN in vivo et/ou ex vivo a récemment fait de grandes avancées méthodologiques. Par exemple, des résultats remarquables ont été obtenus en observant l'incorporation de modifications post-traductionnelles de protéines dans un contexte cellulaire, ou même dans des cellules vivantes en utilisant la micro-injection de la protéine d'intérêt dans des ovocytes de Xenope. Ces études ont démontré que la RMN en extraits et en cellules est particulièrement bien adaptée pour étudier le processus de maturation des macromolécules biologiques, comme les protéines. Le développement de la RMN en cellules pour les acides nucléiques est tout aussi difficile. De la même façon, notre projet vise à étudier les événements de maturation des ARNt avec la même technologie de RMN en cellules.

Nous avons déjà obtenu un certain nombre de résultats, qui démontrent la faisabilité technique et la pertinence de l'étude de la maturation des ARNt par RMN in vivo. En effet, ces expériences montrent que :
(i) les ARNt peuvent être produits par transcription in vitro dans des quantités de l’ordre de la dizaine de mg et purifiés facilement par chromatographie ;
(ii) les spectromètres RMN modernes avec des sondes cryogéniques permettent de mesurer des spectres d’ARNt de très bonne qualité en extraits, même à de faibles concentrations (50-100 uM). Ils permettent également de mesurer des spectres d’ARNt dans des cellules vivantes comme les ovocytes de Xenope ;
(iii) les ARNt sont des ARN stables qui ne sont pas rapidement dégradé dans des extraits cellulaires ou en cellules;
(iv) la cinétique d'incorporation des modifications post-transcriptionnelles est suffisamment lente pour être observable par une série de spectres RMN 2D.
Des stratégies de marquage isotopique judicieuses des ARNt et des co-facteurs ainsi que la mise en œuvre de nouvelles expériences de RMN nous a permis de suivre la maturation des ARNt dans des extraits cellulaires par RMN (résultats à paraître).

Ce projet ambitieux est très innovant tant pour la RMN des ARN que pour les communautés étudiant les ARN(t). Les ARNt sont des molécules fonctionnelles importantes dans toutes les cellules. Dans l'ensemble, il a longtemps été pensé que les modifications des ARNt étaient impliquées presque exclusivement dans l'étape de décodage de la traduction et dans la stabilisation de l'architecture tridimensionnelle des ARNt. Cependant, l'idée que des modifications des ARNt et leurs voies de biosynthèse respectives peuvent être reliées à des fonctions de régulation a récemment émergé. En effet, les nouveaux rôles des modifications des ARNt comme connecteurs entre la traduction, le métabolisme et la réponse au stress ont été récemment découverts. Il est devenu clair que les modifications des ARNt sont essentielles à un contrôle qualité global de l'intégrité cellulaire et que les voies de maturation des ARNt peuvent être placées à la croisée des chemins de diverses voies de régulation tels que la réponse au stress oxydant ou par privation de métabolite. La méthodologie décrite dans ce projet pourrait ouvrir la voie à l'étude moléculaire de ces voies de maturation.

1. Poster at SifrARN meeting (8-10 mars 2016) «The maturation of tRNAs investigated by in cell NMR spectroscopy.»

La spectroscopie de résonance magnétique nucléaire réalisée en cellule (RMN en cellule) représente un nouvel outil biophysique pour explorer les transformations structurales de molécules biologiques, à l’échelle atomique, au sein de cellules vivantes. En effet, la RMN in vivo et/ou ex vivo a récemment connue de grandes avancées, et des résultats remarquables ont été obtenus en observant l’incorporation de modifications post-traductionnelles sur des protéines dans un contexte cellulaire. Ces études ont démontré que la RMN en extraits ou en cellules est particulièrement bien adaptée à l’étude de la maturation de macromolécules biologiques comme les protéines. Selon les mêmes principes, notre projet a pour but d’élucider les évènements de maturation des ARN, principalement des ARN de transfert (ARNt), grâce à la technique de RMN en cellule. La génomique ainsi que les améliorations de certains outils d’analyses biochimiques ont contribué à une renaissance du champ d’étude des modifications des ARNt. Des maladies humaines ont clairement été mises en lien avec l’absence de certaines de leurs modifications. Le rôle des modifications des ARNt comme mécanisme de régulation doit être étudié plus en profondeur. De plus, la plupart des rôles joués par les modifications des ARNt in vivo, reste à découvrir. Ce programme de recherche se fixe pour objectif d’élucider le processus de maturation des ARNt à une échelle atomique. Il vise à obtenir des informations sur la chronologie des évènements qui aboutissent à la biosynthèse d’un ARNt mature et fonctionnel. L’originalité et le challenge de ce programme de recherche intitulé « NMR View of tRNA maturation » (NMR-VitAmin) réside dans l’utilisation de la RMN en extraits et/ou en cellules, afin d’élucider des aspects essentiels de la biosynthèse et de la maturation des ARNt, dans les conditions d’une cellule vivante. La RMN sera également utilisée comme outil de screening en extraits cellulaires, dans le but d’évaluer l’action d’une librairie chimique de petites molécules se liant à l’ARN, sur le processus de maturation des ARNt. En effet, nous avons également comme objectif d’interférer avec ce processus hautement régulé, au sein duquel un déséquilibre des niveaux de modifications observés sur les ARNt, est souvent associé à des pathologies.