Mécanique de fission membranaire induite par ESCRT-III – ESCRTfission

Nous utilisons des approches de biologie moléculaire et de biochimie en combinaison avec des méthodes de biologie structurale telles que la cristallographie aux rayons X et la méthode de SAXS pour étudier la structure de l’hétérodimere CHMP2A et CHMP3 in vitro. Ce travail sera complété par des études de microscopie électronique cellulaire pour comprendre la structure des polymères ESCRT-III in vivo. Des expériences de reconstitution de polymères ESCRT-III in vitro sur les « Giant Unilamellar Vesicles « (GUVs) et sur des tubes membranaires tirés de GUVs avec des pinces optiques sont menés qui donneront un aperçu de la cinétique d'assemblage des protéines ESCRT-III et des forces associées au remodelage de la membrane.

Nous avons collecté des données cristallographiques du dimère de CHMP3, qui représente un modèle potentiel dans la formation de l'hétérodimère CHMP2A-CHMP3, à une résolution de 3,5 Å.
Nous avons caractérisé en outre un certain nombre d’anticorps de lamas et leurs liaisons aux dimères de CHMP3 et identifié quelques mutations qui affectent la polymérisation de CHMP2A.

Nous avons continué l'analyse de « Prototype Foamy Virus » (PFV), sa structure, les particules des capsides présentes dans les cellules infectées, et la reconstruction en 3D de la glycoprotéine insitu, qui a conduit à une récente publication dans PLoS Pathogens.

En ce qui concerne les GUVs, nous sommes maintenant en mesure de tirer des tubes à l'intérieur d’une GUV, évitant ainsi l’incorporation des protéines à l’intérieur des GUVs.
Finalement, nous avons caractérisé l’interaction des protéines ESCRT-III avec la membrane en utilisant la configuration de « Quartz Crystal Microbalance «.Ceci nous a permis de déterminer la composition lipidique optimale afin d’étudier l'interaction des protéines ESCRT-III avec les GUVs (manuscrit en cours de révision).

Le projet est encours.

Alqabandi M;, Miguet, N., Basserau, P. Bally, M;, Weissenhorn, W, and Mangenot, S. (2016) Interaction between ESCRT-III proteins and supported lipid bilayers, PhysChem ChemPhys (under revision).

Effantin G, Estrozi LF, Aschman N, Renesto P, Stanke N, Lindemann D, Schoehn G, and Weissenhorn W (2016) Cryo-electron Microscopy Structure of the Native Prototype Foamy Virus Glycoprotein and Virus Architecture. PLoS Pathog. 2016 Jul 11;12(7):e1005721

M. Kozlov, W. Weissenhorn, P. Bassereau, Membrane remodeling: theoretical principles, structures of protein scaffoldsand forces involved. In: From molecules to living organisms: an interplay between biology and physics. Editors: E. Pebay-Roula et al., Eds. (Oxford University Press (OUP), 2016).

Le complexe ESCRT -III ("Endosomal sorting complex required for transport III") est recruté au cours de la formation des corps multivésiculaires, de la cytocinèse et du bourgeonnement de certains virus enveloppés, pour catalyser l'étape finale de fission de la membrane. Celle-ci est commune à ces processus essentiels cellulaires et pathologiques, en apparence très distincts. Bien que notre groupe et d'autres aient proposé des modèles de fission membranaire par les ESCRT- III, aucune expérience n'a encore permis de déterminer clairement le mécanisme de ce processus fondamental. Dans ce but, nous proposons d'associer des études structurales à haute et moyenne résolution avec des études in vitro sur des tubes de membrane tirés de vésicules unilamellaires géantes (GUVs). Nos objectifs sont: (1) résoudre la structure cristalline du dimère de CHMP3 qui sert de modèle pour l'unité de base des polymères des ESCRT-III, CHMP3-CHMP2A, (2) visualiser les polymères d'ESCRT-III in vivo au site de sortie de virus et (3) reconstituer les protéines ESCRT-III et VPS4 à l'intérieur de tubes de membrane tirés de GUVs pour comprendre le mécanique de fission. L'objectif 1 est en bonne voie car nous avons de petits cristaux et maitrisons des outils de co-cristallisation tels que les nanobodies llama VHH qui faciliteront la cristallisation. Par ailleurs, en cas de difficulté à obtenir des cristaux, nous collaborerons avec un groupe local pour résoudre la structure par RMN. Cette structure nous permettra de générer un modèle quasi-atomique des polymères CHMP3-CHMP2A sur la base de notre carte de microscopie électronique (EM) à moyenne résolution. La structure finale fournira des informations importantes sur les interactions ESCRT-III/membrane et sur la formation des polymères in vitro, deux faits qui seront testées in vivo par des approches de mutagenèse basées sur cette structure. Le deuxième objectif est de visualiser in vivo les ESCRT-III aux sites de sortie de virus par des approches innovantes de microscopie électronique. Nous combinerons les techniques les plus avancées de cryo-microscopie électronique (CEM) seule et de sections vitreuses (CEMOVIS) avec une nouvelle approche pour "geler" les ESCRT-III aux stades finaux du bourgeonnement. Bien qu'il soit difficile de visualiser les ESCR-III in vivo, les développements récents de l'EM avec l'utilisation d'une défocalisation faible (2 à 3 uM) permettront d'imager les filaments ESCRT -III, qui ont au moins 4 nm de largeur au vu des résultats d'EM sur des polymères d'ESCRT-III assemblés in vitro. En plus d'imager le complexe ESCRT - III natif de type sauvage, notre approche nous permettra d'analyser systématiquement le diamètre du cou des bourgeons et d'obtenir ainsi des informations indirectes sur les étapes de constriction du cou. Notre 3ème objectif est de développer des méthodes nouvelles et innovantes pour reconstituer les protéines ESCRT-III et l'ATPase de type AAA VPS4 dans des nanotubes de membrane formé à partir de GUVs. Bien que difficile à reconstituer, cette configuration physiologiquement correcte est absolument nécessaire pour étudier la fonction d'ESCRT- III in vitro. Après avoir testé de nombreuses approches, nous avons mis en place un protocole pour encapsuler les ESCRT-III à l'intérieur de GUVs et tirer des nanotubes membranaires. Cela va nous permettre de déterminer la composition du système de fission minimal et d'étudier les mécanismes de constriction et de fission des membranes par les ESCRTs. Finalement, nos approches fourniront un modèle intégré de l'architecture moléculaire du complexe ESCRT-III qui sera liée à sa fonction de fission des membranes.