Etudes structurales de complexes ribosomaux contenant des peptides naissants préparés à l’aide de flexizymes – RiboFLEX

Le principal obstacle à la cristallisation de ribosomes interagissant avec des peptides d’arrêt est l'obtention de complexes homogènes en quantités suffisantes. Afin de remédier aux déficiences actuelles en matière de préparation des échantillons, nous proposons d’utiliser de petites ribozymes connues sous le nom de flexizymes (Goto et al. (2011) Nat Protocols 6, 779) pour lier des peptides activés préparés synthétiquement à l’extrémité 3’ d’ARNt surexprimés dans un hôte bactérien. Les peptidyl-ARNt obtenus de cette façon pourront être livrés au ribosome en trans, évitant ainsi les problèmes associés à la synthèse de peptides en cis. Grace à cette approche, nous envisageons d’obtenir des structures de complexes ribosomaux diffractant à une résolution de 2,5 à 3,0 Å.

Notre objectif principal sera atteint en trois étapes:

1. La synthèse de peptides activés pouvant être chargés sur des ARNt à l’aide de flexizymes

Nous produirons des peptides d’arrêt d'intérêt biologique dotés de divers groupes partants, de sorte que la totalité des peptidyl-ARNt nécessaires au projet puissent ensuite être préparés à l’aide de flexizymes.

2. Le transfert de peptides activés vers l’extrémité 3’ des ARNt par des flexizymes

Nous préparerons des peptidyl-ARNt non-hydrolysables comportant une liaison amide au lieu de la liaison ester habituelle. Cette modification est nécessaire pour s'assurer que les peptidyl-ARNt résistent au processus de cristallogenèse.

3. La préparation de ribosomes en interaction avec des peptides d’arrêt et l’obtention de leur structure tridimensionnelle par cristallographie aux rayons X

Nous éluciderons les structures atomiques du ribosome bactérien interagissant avec divers peptides d’arrêt courts et nous utiliserons ces modèles comme point de départ pour des expériences structure-fonction.

Le succès de chacune des étapes ci-dessus sera assuré par l'expertise en biologie structurale, en chimie des peptides et en biochimie du consortium riboFLEX.

À ce jour, nous avons préparé la plupart des flexizymes, ARNt et peptides activés nécessaires au projet. Six des 10 combinaisons de groupes partants et de flexizymes testés ont permis de lier des peptides d’arrêt d’intérêt biologique au groupe 3'-OH du tRNAiMet, avec des rendements allant de 20% à 100%. Cependant, nos efforts se focalisent actuellement sur l’amarrage de ces mêmes peptides au 3'NH2-tRNAiMet, car tous les flexizymes existants semblent avoir des difficultés à catalyser la formation de liaisons amides de ce type. En parallèle, nous avons commencé à évaluer si les différents peptides d'arrêt que nous avons choisi d’étudier sont capables d'induire l’arrêt de la traduction par les ribosomes 70S de Thermus thermophilus que nous utilisons pour la cristallogenèse. Une fois que cela sera confirmé, la caractérisation structurale de différents complexes ribosomaux bloqués pourra révéler comment des peptides d'arrêt courts provoquent un arrêt de la traduction chez les bactéries.

Par ailleurs, il est important de souligner que nos analyses cristallographiques de peptides d’arrêt nous ont menés dans une direction inattendue. Ainsi, nous avons pu montrer que certains peptides antimicrobiens riches en proline (PrAMPs) produits par la réponse immunitaire innée des insectes et des mammifères bloquent la traduction grâce à des interactions avec le tunnel de sortie du ribosome bactérien. Les sites de liaison des peptides d’arrêt, des PrAMPs et de divers antibiotiques se chevauchant, il semble évident qu'une meilleure compréhension de ces trois types de ligands pourrait nous aider à concevoir de nouveaux inhibiteurs du ribosome et, par là même, de nouveaux antibiotiques.

Les avancées faites au cours des 18 premiers mois du projet riboFLEX ont donné lieu à deux publications scientifiques dans des revues à comité de lecture internationales de haut niveau. En outre, nous avons présenté nos travaux à divers congrès internationaux, ainsi qu’à des instituts de recherche en France et à l'étranger. Il est cependant trop tôt pour juger de l’impact du projet ou pour définir ses applications directes.

1. Seefeldt, A.C., Nguyen, F., Antunes, S., Pérébaskine, N., Graf, M., Arenz, S., Inampudi, K.K., Douat, C., Guichard, G., Wilson, D.N., Innis, C.A. (2015). The proline-rich antimicrobial peptide Onc112 inhibits translation by blocking and destabilizing the initiation complex. Nat Struct Mol Biol 22, 470-475.

2. Seefeldt, A.C., Graf, M., Nguyen, F., Pérébaskine, N., Arenz, S., Mardirossian, M., Scocchi, M., Wilson, D.N., Innis, C.A. (2016). Structure of the mammalian antimicrobial peptide Bac7(1-16) bound within the exit tunnel of a bacterial ribosome. Nucleic Acids Res. 44, 2429-2438.

Les ribosomes sont de grands complexes ribonucléoprotéiques chargés de décoder et de traduire l'information génétique en protéines. Durant le processus de traduction, les peptides naissants doivent transiter par le long tunnel de sortie qui traverse la grande sous-unité du ribosome afin d’atteindre le milieu intracellulaire. Initialement jugé comme un simple conduit à protéines, ce tunnel est désormais élevé au rang de microenvironnement fonctionnel dans lequel des signaux codés par certains peptides naissants sont relayés vers le site actif du ribosome pour en moduler l’activité. Dans certains cas, la chaîne naissante peut provoquer l’arrêt complet de la traduction, conduisant ainsi à la formation d’un complexe ribosomal bloqué sur l'ARNm. L’arrêt de la traduction par le peptide naissant dépend avant tout de la séquence du peptide en cours de synthèse, mais peut également nécessiter une petite molécule telle qu'un antibiotique ou un acide aminé agissant comme cofacteur. Ce phénomène a été observé chez les procaryotes et les eucaryotes, où il régule l'expression de divers gènes en facilitant ou en bloquant leur accès par l’appareil traductionnel.

Ce projet porte sur deux des exemples les mieux caractérisés de régulation de la traduction par le peptide naissant: (i) l’arrêt de la synthèse des peptides Erm en réponse aux antibiotiques de la famille des macrolides, et (ii) l’arrêt du ribosome sur des tronçons de l'ARNm codant pour des prolines consécutives et sa délivrance par le facteur de traduction EF-P. Nos connaissances actuelles dans ce domaine proviennent de deux sources majeures: les études biochimiques et la cryo-microscopie électronique à résolution moyenne (cryo-EM). Diverses études ont ainsi montré que les peptides d'arrêt sont structurés dans le tunnel de sortie, forment des interactions spécifiques avec le ribosome et altèrent la géométrie du site actif du ribosome afin de bloquer la formation de la liaison peptidique ou l’hydrolyse du peptidyl-ARNt par les facteurs de terminaison. Cependant, un certain nombre de questions demeure concernant la façon dont se déroule le processus d'arrêt. Par ailleurs, un portrait complet de cet aspect fondamental de la biologie du ribosome pourrait permettre la conception d'antibiotiques améliorés qui ciblent le ribosome en imitant les propriétés physico-chimiques des peptides naissants inhibiteurs et de leurs cofacteurs. Des structures à résolution atomique de complexes ribosomaux comportant divers peptidyl-ARNt sont donc nécessaires pour accéder à une compréhension plus approfondie de ce phénomène.

Le but de ce projet est d'obtenir de telles structures par la méthode de la cristallographie aux rayons X et d’utiliser les connaissances tirées de ces structures pour guider des études structure-fonction visant à comprendre comment le ribosome détecte et répond à différentes chaînes naissantes. Jusqu'à présent, de tels complexes ont été préparés à partir de systèmes de traduction in vitro provenant d'un extrait cellulaire ou reconstitués à partir de facteurs de traduction purifiés. Bien que ces méthodes permettent de préparer des complexes ribosomaux en grandes quantités, elles présentent cependant un certain nombre d'inconvénients pour la cristallographie aux rayons X, à commencer par une certaine hétérogénéité moléculaire. Afin de surmonter ces problèmes, nous proposons d'attacher des peptides activés synthétiques à des ARNt à l'aide de petits ribozymes connues sous le nom de flexizymes. En jumelant un groupe partant approprié sur le substrat peptidique avec un flexizyme compatible, pratiquement n'importe quel acide aminé ou peptide peut être fixé sur un ARNt avec une extrémité 3' intacte. Les peptidyl-ARNt obtenus de cette manière peuvent ensuite être ajoutés au ribosome en trans pour mener à bien des études structurales, contournant de ce fait une partie des problèmes associés à la synthèse des peptides en cis par le ribosome.








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