Production in vivo et in silico de mutants affectant les voies de la photosynthèse – ChloroPaths

Le mutant deltarbcL utilise des voies métaboliques alternatives comme des soupapes d'échappement des électrons en excès. Ceci est une façon de cibler spécifiquement les réactions métaboliques alternatives (génération de xxx doubles mutants deltarbcL) par une generation d'une banque criblé par la fluorescence de la chlorophylle dans le contexte deltarbcL. Ensuite, le but sera de placer, par croisement genetique, le mutant dans un contexte de fixation de CO2, où l'obstruction des voies alternatives peut être étudiée en relation avec la productivité photosynthétique. Pour analyser nos mutants nous dépendrons de nombreuses techniques optimisé au laboratoire: l'analyse moléculaire, la localisation et accumulation des protéines, la capture du CO2 par PBR, les tests de croissance sur source de C inorganique / organique, les paramètres photosynthétiques par analyse spectroscopique, et d'autres qui seront externalisées: quantification de métabolites. L’analyse des flux métaboliques et des techniques de modélisation basées sur des contraintes peuvent être utilisées pour comprendre cette régulation complexe de la photosynthèse, la respiration et du métabolisme du carbone. Une telle approche systémique a été démontrée comme étant bien adaptée à l'évaluation de ces interactions pour la souche de type sauvage dans des conditions de lumière limitante. Les suivre dans les souches mutantes dans des conditions contrôlées exigera l'élargissement des représentations de modèles existants et la définition de nouvelles contraintes spécifiques pour l'analyse de modèles, afin d’évaluer les réponses métaboliques potentielles. Des bases de données sont construites et des logiciels open source choisis pour entrer les données concernant les réactions et paramètres. Des PBRs spécifiques sont conçus et testés dans le cadre de la modélisation pour la caractérisation des mutants, où la lumière absorbée peut être mesurée et modélisée avec plus de précision.

Le criblage de la banque mutant a été réalisé avec succès: seize mutants ont été identifiés à partir de dix mille mutants d'insertion avec des phénotypes forts déviant du fond génétique. Parmi ceux-ci, nous avons été en mesure d'identifier, en utilisant des techniques moléculaires basées sur la PCR, la majorité des sites d'insertion .

Les sites d'insertion de dix de ces mutants ont été identifiés dans des gènes qui appartiennent généralement à deux catégories: 1. Les transporteurs, les enzymes et les régulateurs du métabolisme primaire du chloroplaste/cytosol (TPT5, pompe à efflux, kinase pantothénate, DET1, Soluble Starch Synthase 4 , SRR16, protéine avec un motif 2OGFeDO); 2. Des effecteurs protéiques type «control photosynthétique« (APE1, CGL11, chaperonne FeS HSCB-like).

TPT5, APE1and CGL11 ont été complémentés par transformation nucléaire, ce qui prouve que l'interruption de ces gènes est la cause du phénotype mutant. L'analyse de liaison mutation/phénotype est en cours pour les autres mutants ayant leur site d'insertion identifié, prévues jusqu'à la fin de l'année.

Le montage de photobioréacteurs utilisant la mesure en ligne des taux d'absorption de CO2 donne des mesures reproductibles de la photosynthèse et la production de biomasse. Des mutants photosynthetiques publiés ont été utilisé en preuve de concept. Nous avons pu montrer que pgrl1 et npq4 sont des mécanismes compensatoires pour l'adaptation à la lumière élevée, et que pgrl1npq4 montre une forte photoinhibition du PSI.

Un réseau métabolique de la souche de type sauvage de Chlamydomonas a été reconstruit à partir de bases de données disponibles et de la littérature actuelle. Il comprend la compartimentation subcellulaire dans ses principales composantes, à savoir chloroplaste, mitochondrie et cytosol. La mise en œuvre d'un modèle métabolique a été lancée pour calculer les distributions de flux métaboliques de C. reinhardtii dans diverses conditions environnementales et / ou génétiques.

Nous avons des données préliminaires mais convaincantes montrant que nous avons identifié des protéines qui agissent comme des navettes métaboliques entre le chloroplaste et la mitochondrie. Des données phénotypiques, moléculaires et bioinformatiques (basées sur des recherches d'homologie), suggèrent fortement que nous avons identifié un transporteur triose-phosphate et un transporteur d’acide organique ou d’acétate. Les mutants montrent un fort phénotype de fluorescence, qui prouve sa relation avec le transfert d'électrons photosynthétiques. Nous pensons que nous avons identifié à la fois le translocateur de triose-phosphate et la valve malate très recherchés dans ce criblage.

En outre, le travail de l'équipe de modélisation révèle que ces interactions métaboliques entre le chloroplaste et la mitochondrie pourraient favoriser la production de biomasse en conditions photo-autorophique en régime permanent. L’équipe travaille actuellement à comprendre les goulots d'étranglement physiologiques qui limitent ces interactions pour apporter des données à nos études pour l’amélioration de souches.

D'un angle différent la deuxieme groupe de mutants qui ont été isolés dans ce crible nous révèlent que le contexte mutant deltarbcL que nous avons utilisé comme arrière-plan génétique déclenche des réponses d'acclimatation, qu'on peut observer par des profils de fluorescence pendant une transition de l’obscurité à la lumière. La protéine lumenale CGL11 et la protéine des thylakoïdes APE1 identifiés de notre banque, demontrent une réponse d'acclimatation appelée «contrôle photosynthétique» que nous avons deja etudié chez le mutant PGR5. Cette controle est en mesure de relier le transfert d'électrons, le gradient de protons, la production d'ATP et le NPQ et est donc au centre de l’acclimatation. Cela ouvre des perspectives dans le domaine du contrôle photosynthétique, et leur manipulation à la fois chez les algues vertes et les plantes pourrait augmenter le rendement en biomasse.

1. Chaux F, Peltier G, Johnson X. A security network in PSI photoprotection: regulation of photosynthetic control, NPQ and O2 photoreduction by cyclic electron flow. Front Plant Sci. 2015 Oct 15;6:875. dx.doi.org/10.3389/fpls.2015.00875
2. Steinbeck J, Nikolova D, Weingarten R, Johnson X, Richaud P, Peltier G, Hermann M, Magneschi L, Hippler M. Deletion of Proton Gradient Regulation 5 (PGR5) and PGR5-Like 1 (PGRL1) proteins promote sustainable light-driven hydrogen production in Chlamydomonas reinhardtii due to increased PSII activity under sulfur deprivation. Front Plant Sci. 2015 Oct 27;6:892.
dx.doi.org/10.3389/fpls.2015.00892
3. Chaux F, Johnson X, Cuiné S, Auroy P, Beyly-Adriano A, Te I, Lucas PL, Peltier G. PGRL1 and LHCSR3 Can Play Compensatory Roles in the Control of Photosynthetic Electron Flow During High Light Acclimation to Sustain Carbon Dioxide Uptake and Avoid Photosystem I Photoinhibition. Under revision for Mol. Plant.
4. Dumas L, Chazaux M, Peltier G, Johnson X, Alric J. Cytochrome b6f function and localization, phosphorylation state of thylakoid membrane proteins and consequences on cyclic electron flow. Photosynth Res. 2016 Aug 17.
PMID: 27534565

1. Pawel Brzezowski, invited speaker at 17th International conference on the cell and molecular biology of Chlamydomonas, Kyoto Japan, 20 June 2016.
2. Pawel Brzezowski, poster presentation at 17th International conference on the cell and molecular biology of Chlamydomonas, Kyoto Japan, 20 June 2016.
3. Xenie Johnson, invited speaker at PS electron transfer Satellite conference, Arnhem, August, 2016
4. Marie Chazaux, poster presentation at 17th International conference on Photosynthesis, Maastricht, August, 2016.

1. Xenie Johnson invited speaker at Journees de la Photosynthese: Societe Francaise de la Photosynthese, Paris May 2015
2/3. Pawel Brzezowski and Marie Chazaux,, poster presentation at Journees de la Photosynthese: Societe Francaise de la Photosynthese, Paris May 2016

Les microalgues représentent une ressource naturelle renouvelable pour la production de molécules à haute valeur ajoutée. Elles ont été jusqu’à présent assez peu exploitées car on leur a préféré les plantes de cultures, plus adaptées à l’exploitation agricole traditionnelle. Les avancées technologiques en génie des procédés permettent aujourd’hui de cultiver les microalgues à moyenne-échelle en photo-bioréacteurs. Alors que la production hétérotrophe (microalgues nourries avec du sucre) permet d’atteindre des rendements conséquents, la production photoautotrophe, la seule qui soit proprement renouvelable (avec la lumière du soleil comme seul apport énergétique), donne des rendements satisfaisants mais limités. Nous pensons qu’il est possible d’accroître ces rendements de production de biomasse algale en comprenant mieux quelles sont les limitations énergétiques et les contraintes métaboliques de ces organismes. Un enjeu d’avenir est de domestiquer les microalgues pour la monoculture comme nous l’avons fait pour les plantes céréalières par le passé.
Ce projet de recherche propose une approche combinée d’études génétiques, métaboliques et physiologiques pour comprendre les limitations du rendement de la production photosynthétique de biomasse algale, pour tenter de lever ces limitations. La microalgue retenue pour cette étude, une bonne représentante de la lignée verte, est Chlamydomonas reinhardtii. Elle est bien adaptée aux questions de recherche fondamentale et appliquée : tout un panel de techniques moléculaires de caractérisation génétique y ont été mis au point, et des photo-bioréacteurs dédiés ont été conçus pour la produire à grande échelle (en collaboration avec l’entreprise Microphyt).
Le principe de notre approche scientifique est très simple : il est basé sur le constat que les mécanismes moléculaires de la photosynthèse se composent de plusieurs voies métaboliques interconnectées. La voie majeure conduit à la fixation de CO2 et à l’accroissement de la biomasse. Les autres dites « alternatives », sont impliquées dans des mécanismes de régulations, dont certains sont d’importance cruciale dans les conditions naturelles, mais représentent une dissipation énergétique (et donc une perte de biomasse). En conditions de culture contrôlées (éclairement moyen, fort CO2), on peut penser que la régulation des voies alternatives devient superflue et qu’il est possible d’en bloquer certaines pour rediriger le flux énergétique vers la fixation de CO2 sans nuire à la viabilité du système biologique. En faisant cela nous aurions rempli notre objectif de domestication.
La méthode envisagée pour parvenir à notre objectif est originale. Elle n’a jamais été tentée auparavant et repose en grande partie sur l’expérience génétique que nous avons accumulée ces dernières années. Il s’agit de partir d’une souche mutante où la voie majeure de fixation de CO2 a été bloquée (mutant sans Rubisco). Dans cette souche, les voies alternatives deviennent donc, par la force des choses, les voies majoritaires. Ce fonds génétique dépourvu de Rubisco représente donc une bonne souche réceptrice pour interrompre les voies alternatives en générant des doubles mutants. Après une série d’étapes de caractérisation approfondie, décrites en détail dans le projet, nous replacerons ces mutations sur les voies alternatives dans le contexte « sauvage ». En d’autres termes, après un croisement avec la souche sauvage nous sélectionnerons les descendants ayant retenu la mutation sur les voies alternatives mais ayant retrouvé l’activité Rubisco de fixation de CO2.
Tout un travail de modélisation fonctionnelle de la croissance nous permettra de comprendre l’interaction entre les voies métaboliques des composés carbonés, de mieux décrire le phénotype des mutants isolés dans notre approche génétique et peut-être de planifier de façon plus rationnelle des projets de biologie synthétique pour le futur pour l’amélioration raisonnée des microalgues.