Hydrogénases résistantes à l’Oxygène – HEROS

Ce projet interdisciplinaire a nécessité l’utilisation et le développement de nombreuses techniques. Des techniques de biologie moléculaire et en particulier la technique du SLIC (sequence- and ligation-independent cloning) ont été utilisées pour la délétion de gènes et le clonage de gènes dans la bactérie Escherichia coli. L’optimisation des cultures bactériennes a été réalisée grâce à une plateforme de fermentation en conditions contrôlées. Les hydrogénases ont été purifiées avec des techniques usuelles de biochimie (chromatographie d’affinité). Les hydrogénases purifiées ont été caractérisées par électrochimie directe et par des méthodes biophysiques, en particulier par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE). Différentes approches de spectroscopies RPE ont été utilisées afin d’étudier l’interaction entre le dioxygène et les centres métalliques de l’enzyme. La cristallographie a permis de clarifier le rôle de certaines cavités dans le transport des molécules de dioxygène à l’intérieur de l’enzyme. Des calculs de chimie théorique, en lien avec les données expérimentales ont été réalisés afin de déterminer les chemins réactionnels suite à l’inhibition par le dioxygène des hydrogénases NiFe et la formation des états inactifs (NiA et NiB) ainsi que leur structure probable.

L'enzyme Hyd-1 a été produite de façon homologue dans E. coli à partir d’un plasmide mais en faible quantité sous forme soluble (présente majoritairement en corps d’inclusion). Nous avons construit, produit et purifié différents mutants des ligands du centre FeS proximal qui est important pour la résistance à l’O2 [1], et le mutant V78C de la grande sous-unité. L’activité de l’enzyme sauvage est environ 30 fois plus importante que celle reportée dans la littérature dans les mêmes conditions (32 U/mg vs 1 U/mg). La mutation V78C a permis d’augmenter la résistance à l’oxygène d’une hydrogénase naturellement tolérante.

La production et la purification des hydrogénases Hyd-1 et Hyd-2 et de leurs mutants est difficile à cause de la formation de corps d'inclusion et des processus de maturation post-traductionnels complexes. Différentes solutions ont été testées mais l’optimisation de leur production est essentielle pour envisager leur caractérisation spectroscopique afin de comprendre les déterminants moléculaires de la résistance au dioxygène. L’enzyme mutante V78C, la plus résistante à l’oxygène testée au laboratoire jusqu’à présent, pourra être utilisée dans des biopiles à combustible par une autre équipe du laboratoire.

Ce projet a conduit à la publication de sept articles dans des journaux à comité de lecture dont les facteurs d’impact varient de 2,95 (J. Biol. Inorg. Chem) à 20,95 (Account of chemical research) avec une moyenne de 7,8. Un de ces articles concerne le travail des collaborateurs italiens non-financés par l’ANR. Une publication est en cours. Les deux personnels employés par ce projet sont auteurs de ces publications : 1 article pour l’ingénieure d’étude et 4 articles pour la postdoctorante.

L’hydrogène serait un vecteur énergétique propre s’il pouvait être produit de façon écologique. Une possibilité serait de le synthétiser par des approches biologiques, en particulier en utilisant des organismes photosynthétiques qui couplent l’oxydation de l'eau à la production de H2 grâce à des catalyseurs biologiques appelés hydrogénases. Ce sont des metalloenzymes complexes qui catalysent l'oxydation et la production de H2 au niveau d'un site actif bi-métallique (FeFe ou NiFe). La compétition intense dans ce domaine de recherche est motivée en partie par l’utilisation potentielle des hydrogénases dans des systèmes biotechnologiques. La recherche se focalise particulièrement sur leur inactivation par l'O2 qui limite grandement leurs applications. Utiliser l'ingénierie rationnelle des protéines pour rendre tolérantes à l'O2 les hydrogénases d'organismes photosynthétiques pourrait être envisagé si le mécanisme d'inactivation était compris.
Les résultats spectaculaires obtenus récemment par les partenaires de ce projet ont souligné la nécessité de maintenir les efforts quant à l'étude des mécanismes de résistance et de sensibilité à l'O2 des hydrogénases à NiFe. En 2013, dans Nature Chemical Biology, nous avons remis en question le mécanisme d'inactivation oxydante des hydrogénases à NiFe et remis en question la structure chimique des états inactifs. Dans PNAS et JACS en 2012, nous avons décrit une série de mutants d'une hydrogénase sensible dont la tolérance à l'O2 est considérablement augmentée, par un mécanisme qui nécessite encore d'être étudié de manière approfondie.
Dans ce projet, notre objectif est d'utiliser de nouvelles méthodes et approches pour repenser et approfondir la connaissance des mécanismes d'inactivation et de tolérance à l'O2 des hydrogénases à NiFe.
Les quatre équipes des laboratoires français et les trois laboratoires étrangers participant à ce projet ont déjà fructueusement collaboré. Ces laboratoires sont experts dans le domaine des métalloenzymes (en particulier les hydrogénases) et maîtrisent les outils biochimiques, spectroscopiques, électrochimiques et théoriques utilisés depuis plusieurs années pour étudier ces enzymes dans le cadre d'un réseau de collaboration pluridisciplinaire à l'interface biologie/chimie/physique.
Nous utiliserons notre système génétique modèle pour produire en routine l'hydrogénase sensible de Desulfovibrio fructosovorans et divers mutants plus résistants. Nous allons aussi développer la production et la purification de l’hydrogenase naturellement résistante de Salmonella enterica Typhimurium et de E. coli. D’autre part, nous allons mettre en place la production d'enzymes artificielles chimériques.
Nous développerons et utiliserons de nouvelles méthodes électrochimiques, la chimie théorique et des techniques spectroscopiques à haute résolution pour caractériser ces enzymes par l’approche pluridisciplinaire qui caractérise le laboratoire de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines. Les trois différentes équipes de ce laboratoire participeront au projet avec leurs différentes approches (biologie moléculaire, électrochimie, spectroscopie RPE), et les trois partenaires étrangers recrutés apporteront leur expertise spécifique (spectroscopie infrarouge et chimie théorique). La production à grande échelle des enzymes d’intérêt sera mise en place et optimisée à l’Institut méditerranéen d'océanologie (MIO), elle sera cruciale pour les études biophysiques et pour les futures applications biotechnologiques. Les meilleures enzymes produites dans le projet seront utilisées par un consortium de chercheurs financés dans le cadre d’une ANR (CAROUCELL ANR 2013 BIOME) dont le but est d’élaborer des biopiles à combustibles.
Les résultats obtenus permettront de rationaliser l’ingénierie des hydrogénases à NiFe d’organismes photosynthétiques, ce qui rendra possible la conception de systèmes de photoproduction biologique de H2.