Biologie synthétique: l'exocytose – SynBioExo

Développer des méthodes pour livrer les PNA auxmembranes représentant les vésicules et membrane plasmique d'une cellule d'une manière reproductible. Nous voulons imiter et reproduire, les principales étapes de l'exocytose, à savoir « tethering/docking » et fusion, in vitro. Nous allons d'abord optimiser indépendamment chacune de ces étapes, puis les combiner pour concevoir le processus d'exocytose avec PNA. Une fois cet objectif atteint, nous allons essayer de fournir un signal artificiel (également fondé sur la technologie PNA) pour induire l'exocytose au lieu et au moment désirés.
A la fin de ce projet, nous serons en mesure de reproduire et reprogrammer complètement l'étape de « tethering/docking » et/ou l'étape de fusion en utilisant les PNA. L'exocytose pourra alors être réalisée, contrôlée et déclenchée artificiellement par ces molécules synthétiques.

Nous avons reproduit les étapes de «tethering/docking« avec des brins d'ADN. Nous avons aussi, par des origamis d'ADN, fabriqué des vésicules de dimension parfaitement caractérisée et similaire à celles des vésicules synaptiques.

A la suite de ce projet, nous souhaitons transférer les résultats de cette études à la cellules et, à termes, pouvoir complètement reprogrammer l'exocytose cellulaire à l'aide de molacules synthétiques.

1. W. Xu, J. Wang, J.E. Rothman, F. Pincet, “Accelerating SNARE-mediated Membrane Fusion by DNA-lipid Tethers”, Angewandte Chemie, 54,14388-14392 (2015).
2. W. Xu, B. Nathwani, C. Lin, J. Wang, E. Karatekin, F. Pincet, W. Shih, J.E. Rothman, «A Programmable DNA Origami Platform to Organize SNAREs for Membrane Fusion«, J. Am. Chem. Soc., 138: 4439?4447 (2016).
3. F. Pincet, V. Adrien, R. Yang, J. Delacotte, J.E. Rothman, W. Urbach, D. Tareste, “FRAP to Characterize Molecular Diffusion

L'exocytose est l'un des processus physiologiques fondamentaux dans la cellule. Diverses fonctions essentielles comme la sécrétion des hormones ou des enzymes et la libération des neurotransmetteurs à la synapse se font grâce à l’exocytose. Ainsi, un dysfonctionnement de ce processus peut conduire à de nombreuses maladies telles que le diabète ou des maladies neurodégénératives (Alzheimer, etc ...). L'exocytose se produit quand une vésicule initialement dans le cytosol et contenant des solutés (enzymes, hormones ou neurotransmetteurs) fusionne avec la membrane plasmique, libérant son contenu dans l'espace extracellulaire. Il a plusieurs étapes successives: l’accrochage lâche de la vésicule à la membrane cytoplasmique, suivi par un lien plus serré, et la dernière étape impliquant l'assemblage du complexe SNARE qui entraîne la fusion membranaire. Ainsi, les étapes de base sont accrochage lâche (tethering), lien étroit (docking) et fusion. Dans certains cas spécifiques, une étape intermédiaire est ajoutée : l’assemblage des complexes SNARE est commencé mais arrêté à mi-chemin. Cela permet une libération rapide et synchrone d'un signal de déclenchement (par exemple, l'apport en calcium pour la neurotransmission). Le « tethering » et le « docking » sont effectués par des protéines capables de se lier lorsque la vésicule est encore loin de la membrane plasmique (dizaines de nm). La fusion est réalisée par des protéines SNARE complémentaires présentes dans la vésicule (v-SNARE) et la membrane plasmatique cible (t-SNARE). Lors de l'assemblage des SNAREs, la vésicule et la membrane plasmique sont contraintes à se rapprocher jusqu’à un contact quasi-moléculaire qui induit la fusion.
Nous avons, ainsi que d'autres groupes, montré que l'étape de « tethering/docking » ainsi que le processus de fusion peuvent être reproduits artificiellement in vitro en utilisant des molécules de synthèse, de l'ADN ou des acides nucléiques peptidiques (PNA). Dans ce projet, nous prévoyons d'utiliser ces outils pour reprogrammer les cellules en créant une voie cellulaire artificielle pour la libération contrôlée de substances stockées, c’est-à-dire que nous voulons fabriquer de l’exocytose synthétique. Nous ferons ceci en deux phases distinctes mais interdépendantes: (i) Développement in vitro d’un prototype programmable, d’exocytose commutable exocytose fondée sur l’ADN et les PNA et (ii). Développer des méthodes pour livrer les PNA aux vésicules et à la membrane plasmique d'une cellule d'une manière reproductible. Cela nous permettrait d’utiliser le prototype développé in vitro à des conditions in vivo. Nous voulons imiter et reproduire, les principales étapes de l'exocytose, à savoir « tethering/docking » et fusion, à la fois in vitro et in vivo. Nous allons d'abord optimiser indépendamment chacune de ces étapes, puis les combiner pour concevoir le processus d'exocytose avec PNA. Une fois cet objectif atteint, nous allons essayer de fournir un signal artificiel (également fondé sur la technologie PNA) pour induire l'exocytose au lieu et au moment désirés.
A la fin de ce projet, nous serons en mesure de reproduire et reprogrammer complètement l'étape de « tethering/docking » et/ou l'étape de fusion en utilisant les PNA. Exocytose pourra alors être réalisée, contrôlée et déclenchée artificiellement par ces molécules synthétiques. La reprogrammation de la cellule avec des molécules synthétiques ouvrirait de nouvelles perspectives dans le domaine fondamental de la biologie cellulaire et en médecine. Au niveau fondamental, ce projet nous permettra de mieux contrôler et comprendre comment chaque étape de l'exocytose fonctionne et, pourra inspirer d’autres équipes pour programmer d’autres processus cellulaires avec des molécules synthétiques. Au niveau plus appliqué, il fournira un nouveau moyen de réparer ou de contrôler la sécrétion d'hormones ou la libération de neurotransmetteurs dans diverses maladies par une approche complètement nouvelle.