Nouvelle exploration du tropisme et de la dissémination des Paramyxoviridae encephalitogènes – NITRODEP

L'utilisation de cultures organotypiques cérébrales murines combinée à la génétique inverse nous permet ici de suivre, en temps réel, le tropisme et la dissémination de différents virus sauvages, incapables de lier leur recepteur ou dont l'expression des protéines virales est placée sous régulation cellulaire dans une architecture tridimensionnelle tissulaire conservée en microscopie à fluorescence et cytometrie de flux.

L’état d’activation des cellules du système nerveux central semble régir la susceptibilité à l’infection. Le tropisme du virus de la rougeole est indépendant des récepteurs connus. La susceptibilité des astrocytes et des microglies dépend en effet de cet état. La susceptibilité microgliale est pour partie dépendante de l’interféron de type 1. Le virus encéphalitogène F L454W infecte à basse température en l’absence de récepteur connu. Le virus Nipah peut infecter tous les types cellulaires testés. La dissémination du virus de la rougeole semble dépendante de la capacité de sa protéine d’attachement H à lier un récepteur utilisant la position 533 de la glycoprotéine virale. Les deux glycoprotéines virales semblent indispensables à une bonne dissémination du virus même si une diffusion cellule-cellule à très bas bruit reste possible.

Nous avons caractérisé/déterminé les meilleures conditions pour infecter nos modèles ex vivo. L’état d’activation des cellules du système nerveux central régit plus la susceptibilité à l’infection que la présence des récepteurs connus. Le tropisme et la dissémination du virus de la rougeole est indépendant du récepteur Nectin4. Le mutant encéphalitogène F L454W est hyperfusogène à basse température en l’absence de récepteur connu. Le virus Nipah peut infecter tous les types cellulaires testés. Nous nous tournons maintenant vers l'analyse de l'implication des glycoprotéines virale dans la dissémination dans l'idée de pouvoir un jour des traitements capable de cibler non seulement les protéines de surfaces virales mais aussi d'activer la réponse antivirale cérébrale afin de limiter l'invasion du système nerveux central par ces virus provoquant des infection létales.

Au travers de ce projet nous avons caractérisé les coupes organotypiques pour standardiser leur utilisation en neurovirologie. Ceci nous a permis de mettre en évidence que la susceptibilité des Astrocytes et microglies dépend de la réponse interféron et de leur état d’activation (Welsch et al, papier 1 soumis). Nous avons également montré que instabilité de la protéine de fusion de virus de la rougeole suffit à outrepasser l’expression d’un quelconque récepteur d’entrée (Jurgens, mathieu et al, Mbio 2015). Néanmoins, la dissemination du virus de la rougeole repose sur sa protéine d’attachement et surtout sur une zone de liaison à un récepteur connu qui n’est pourtant pas exprimé dans le cerveau (Welsch et al papier 2 en écriture). Enfin le système organotypique a permis d’évaluer l’effet de nouveaux composés antiviraux contre le virus Nipah et le virus de la rougeole dans le tissus cérébral (Mathieu et al, Expert Rev Anti Infect Ther 2015 ; Bloyet et al, j virol 2016)

De très nombreux virus ARN sont neurotropes et provoquent diverses atteintes neurologiques. L’issue de ces infections dépend du virus et des neurones infectés. Dans le tissu nerveux, de nombreux virus peuvent persister, produisant moins de particules infectieuses libres. Toutefois, bon nombre d’entre eux peuvent se disséminer efficacement dans le système nerveux central (SNC) suggérant que la transmission de cellule-cellule s’effectue d’une manière différente de celle généralement observée en périphérie. Le but de ce projet est d’élucider la manière dont les virus neurotropes se disséminent au sein du SNC. Nous nous focalisons sur le virus de la rougeole (VR) et le virus Nipah (NiV), qui appartiennent aux deux genres les plus proches dans la famille des Paramyxoviridae, et partagent une même stratégie de transcription et de réplication. L’homme est le seul hôte du VR dont l’infection entraine une maladie dite légère pouvant conduire parfois à des atteintes sévères à mortels. Le NiV peut infecter de nombreux mammifères, dont l’homme avec une mortalité associée pouvant atteindre 90%, et nécessite donc d’être manipuler dans un laboratoire P4. Tandis que le NiV a émergé il y a une décennie, le VR re-émerge et cause régulièrement des épidémies partout dans le monde. Tout deux peuvent infecter les cellules neurales et provoquent aussi bien des encéphalites létales que des infections persistantes à l’origine de rechutes plusieurs mois/années après l’infection initiale. Tandis que l’infection du système nerveux central par le VR est plutôt rare, celle-ci est presque systématique avec le NiV. Dans les deux cas la neuro-pathogénèse associée à ces infections reste peu comprise.
Dans cette étude, nous utiliserons une combinaison de cultures primaires neurales et organotypiques de cerveaux issus de modèle de souris transgéniques afin d’analyser la dissémination de ces deux virus neurotropes dans l’idée que la comparaison de ces deux infections permette de réaliser de nouvelles avancées/découvertes concernant chacune d’entre elles. L’objectif est de répondre à 5 questions (i) Ces virus utilisent-ils des récepteurs connus ou alternatifs pour entrer et envahir le SNC ? (ii) Quelle glycoprotéine(s) est nécessaire/impliquée dans l’entrée/dissémination de cellule a cellule ? (iii) Comment le core viral est transporté depuis le site d’entrée jusqu’à la sortie du virus en assumant une dissémination de cellule à cellule ? (iv) Les constituants protéiques viraux s’assemblent-ils correctement pour donner naissance à des particules infectieuses responsables de la transmission du virus de cellule à cellule ? (v) Comment la sélectivité de la propagation virale au sein d’un réseau limité de neurones est-elle gouvernée?
In vitro et ex vivo, les études de l’infection par le VR et NiV bénéficieront des outils suivants : (i) des cultures de cellules primaires et d’explants de cerveaux issus de modèles de souris transgéniques exprimant ou non les récepteurs d’entrées connus des virus. (ii) des outils moléculaires permettant de bloquer l’entrée/fusion et la dissémination virales, (iii) des virus recombinants exprimant des glycoprotéines « aveugles » pour leurs récepteurs et/ou dont l’expression des protéines d’enveloppe est abolie. Enfin l’identification de sous-types neuraux ciblés par les virus sera entreprise à l’aide de virus recombinants exprimant deux protéines fluorescentes dont l’une aura son expression contrôlée par divers microARN exprimés dans le cerveau.
Les résultats issus du présent projet serviront à mieux comprendre comment les infections par ces virus évoluent vers des maladies du système nerveux central. La détermination de l’état dans lequel se trouvent ces virus au cours de l’infection et celle des mécanismes de transferts inter-neurones pourraient conduire au développement de thérapies capables de contrôler l’extension des syndromes neurologiques mortels associés à ces infections.