Test électrochimique de transcétolase pour le screening d’inhibiteurs en microplaques – TRANSBIOSCREEN

Au niveau du métabolisme cellulaire, la transcétolase TK est l’enzyme-clef dans le segment non-oxydatif de la voie des pentoses phosphates qui conduit à la biosynthèse du D-ribose-5-phosphate (D- phosphates. L’activation de cette vois de biosynthèse a été mise en évidence dans la prolifération anormale des cellules cancéreuses. Par ailleurs, la déficience en activité de transcétolase a été mise en évidence pour les patients atteints de maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer.
Dans ce contexte, la TK a été envisagée comme une cible thérapeutique (recherche d’inhibiteurs de l’enzyme) dans le traitement du cancer. Ainsi, nous envisageons de développer un test électrochimique de transcétolase en microplaques 96 puits pour le criblage à haut débit d’inhibiteurs potentiels de cette enzyme. En effet, dans le domaine de la bioélectronique, le criblage rapide d’activité enzymatique par voie électrochimique est toujours un challenge.
Notre système sera composé de 96 électrodes sérigraphiées sur circuit imprimé et adapté pour l’utilisation commerciale. (L’électrode de travail est en carbone, et l’électrode de référence, comme la contre-électrode, sont en argent (Ag/AgCl). Les modules associés (multipotentiostat), permettent de réaliser des mesures en quelques secondes sur 96 microélectrodes en même temps. On notera, que l’analyse peut être réalisée sur un volume d’échantillon très faible, typiquement 30 à 50 µL. De plus, cette méthode permet de s’affranchir de l’utilisation de réactifs, et comme les circuits-imprimés sont réutilisables, les coûts d’analyse sont bas.
L’originalité de ce travail réside dans l’immobilisation de la TK sous sa forme apoenzyme (sans cofacteur). Les inhibiteurs de TK les plus actifs décrits jusqu’alors sont des analogues de thiamine pyrophosphate, c’est à dire des inhibiteurs compétitifs du cofacteur naturel de la TK.
Le premier challenge de ce projet consiste à proposer un multi-enzymatique adéquat, comprenant une ou plusieurs enzymes auxiliaires, pour convertir l’activité enzymatique de TK en un signal électrique mesurable.
Le développement de ces biocapteurs requiert l’immobilisation d’enzymes sur le transducteur (électrode). L’approche retenue s’oriente autour de l’encapsulation d’enzymes sur des matériaux inorganiques lamellaires, soit de type hydroxydes doubles lamellaires (HDL), soit des argiles cationiques. Ces matériaux sont particulièrement biocompatibles pour l’immobilisation d’enzyme. Le mode de transduction du signal envisagé est celui du transfert d’électron assisté par un médiateur. La modulation de la réponse enzymatique en fonction de différents inhibiteurs sera réalisée en utilisant des microélectrodes sérigraphiées en format microplaques 96 puits, ceci afin d’assurer un débit suffisant. Le but ultime serait de rendre notre système utilisable tel quel pour le criblage de banques de composés synthétiques. Le projet, de part sa nature multidisciplinaire, nécessite une combinaison de compétences et d’expertises variées. F. Charmantray, le coordinateur de ce projet, apportera son expérience dans le domaine de la biocatalyse, et plus précisément dans le domaine de l’utilisation d’enzymes en cascade. De plus, il est aussi responsable de la plateforme de criblage automatisée du laboratoire ICCF. Cette plateforme est dédiée au criblage enzymatique dans des systèmes miniaturisés. F. Charmantray propose la constitution d’une équipe de jeunes chercheurs appartenant au laboratoire ICCF, UMR CNRS 6296 (V. Prévot, Aubière) et à l’ICBMS (B. Doumèche). V. Prévot est une experte dans le domaine de la chimie des matériaux biohybrides dérivés de HDL, alors que B. Doumèche apportera ses compétences dans le domaine de la transduction du signal électrochimique dans des systèmes miniaturisés. L. Hecquet (ICCF-Aubière) apportera ses connaissances dans le domaine de la biocatalyse et C. Mousty (ICCF-Aubière) dans le domaine de l'électrochimie appliquée au développement de biocapteurs.