Etude structurale et fonctionnelle du complexe MAST2/PTEN, impliqué dans le contrôle de la survie neuronale. – MAST-2-PTEN

La phosphatase PTEN (phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10) est exprimée dans les neurones. PTEN est un inhibiteur de la neurogénèse et de la survie neuronale. Des changements dans son niveau expression ont été observés dans des maladies neurologiques. PTEN est un verrou majeur bloquant la régénération naturelle des nerfs périphériques. Son activité dépend de son état de phosphorylation contrôlé plusieurs kinases neuronales, dont MAST2 (Microtubule-associated Ser/Thr kinase 2). MAST2 appartient à la famille des kinases AGC et est un inhibiteur de la neurogénèse et de la survie neuronale comme PTEN. La phosphorylation de PTEN par MAST2 est facilitée par la formation d’un complexe entre le domaine PDZ de MAST2 et l’extrémité C-terminale de PTEN (PTEN-Ctail). Il a été proposé qu’un équilibre conformationnel ouvert/fermé de PTEN, dépendant de la phosphorylation de PTEN-Ctail, assure sa stabilité, contrôle son trafic cellulaire et détermine sa fonction. Nous avons récemment démontré que le virus de la rage favorise la survie des neurones qu’il infecte en ciblant spécifiquement cette interaction (Préhaud et al., Science Signaling, 2010). La glycoprotéine de ce virus dissocie le complexe MAST2/PTEN et de ce fait modifie le trafic cellulaire de PTEN (Terrien et al., Science Signaling, 2012). Par ailleurs, nous avons identifié par RMN le profil et les cinétiques de phosphorylation de PTEN-Ctail dans des extraits de cellules neuronales (Cordier et al., J.A.C.S., 2012).
Notre objectif est d’étudier comment le complexe MAST2/PTEN et la phosphorylation de PTEN-Ctail contrôlent la conformation de la phosphatase et sa localisation cellulaire, et d’établir le rôle de MAST2/PTEN dans la neurosurvie. Les sites de phosphorylation et les cinétiques associées de PTEN-Ctail seront étudiés par RMN, in vitro, dans des extraits neuronaux et, plus ambitieux, en cellules entières. Le modèle conformationnel ouvert-fermé de PTEN essentiel à l’activité de la phosphatase et sa dépendance vis à vis de la phosphorylation seront également caractérisés in vitro. Enfin, nous déterminerons la structure du domaine kinase de MAST2 et nous caractériserons son activité catalytique. L’organisation en domaine de grandes protéines et le caractère transitoire des phosphorylations et des équilibres conformationnels sont autant de défis expérimentaux pour l’étude de grand système tel que MAST2/PTEN. Nous avons décidé d’utiliser la RMN couplée au SAXS afin d’étudier en solution les équilibres conformationnels et la dynamique des protéines modulaires MAST2 et PTEN, combinées à la cristallographie aux rayons X pour déterminer la structure des domaines rigides tels que le domaine kinase de MAST2. En parallèle, l’impact de MAST2 sur la localisation cellulaire de PTEN et son activité dans la survie neuronale seront étudiés dans des cultures de neuroblastomes humaines.
Pour atteindre nos objectifs, notre projet MAST-2-PTEN regroupe trois laboratoires académiques: le groupe de Nicolas Wolff (Institut Pasteur, Paris), spécialisé dans l’étude structurale des protéines et de leurs interactions; le laboratoire dirigé par Martin Blackledge (Institut de Biologie Structurale, Grenoble) expert en dynamique et flexibilité conformationnelles des protéines; et l’Unité de Monique Lafon (Institut Pasteur, Paris), spécialisée en biologie cellulaire neuronale. Nous abordons ensemble les mécanismes moléculaires et cellulaires concernant deux protéines contrôlant la Neurosurvie; les résultats escomptés devraient faire progresser nos connaissances sur la survie des neurones tout en étudiant la relation structure-fonction de la famille mal connue des kinases MAST et en précisant le rôle de la phosphatase PTEN. Contrer l’action inhibitrice de MAST2 et de PTEN dans la neuroprotection en déstabilisant le complexe formé par ces deux protéines devrait conduire à de nouvelles thérapies neuroprotectrices.