Localisation membranaire de la RNase E : rôle dans la maturation, la surveillance et la dégradation des ARNm – memRNase

Ce projet est basé sur la collaboration de trois partenaires. Des approches systémiques seront utilisées pour déchiffrer les fonctions régulatrices globales de la RNase E sur le profil d’expression de l’ensemble du génome, sur la mesure de la stabilité des transcrits cellulaires et sur la cartographie des événements de maturation de l’ARN. Notre stratégie produira des données avec une résolution à l’échelle du nucléotide. Des cartographies globales des cibles ARN de la RNase E lorsqu’elle est localisée à la membrane ou dans le cytoplasme seront produites. Une comparaison des deux jeux de données donnera des informations sur l’accessibilité aux substrats en fonction de la localisation cellulaire de la RNase E. Une souche mutée exprimant la RNase E cytoplasmique sera caractérisée au niveau moléculaire. L’expertise complémentaire de chacun des partenaires est essentielle à l’accomplissement du projet. Le partenaire 1 possède une vaste expérience dans le domaine de la dégradation de l’ARNm bactérien et a récemment découvert que la RNase E est localisée à la membrane cytoplasmique interne. Le partenaire 2 possède une vaste expérience dans l’utilisation d’approches systémiques pour déchiffrer la physiologie et le métabolisme bactérien. Le partenaire 3 a une expertise reconnue dans les analyses bioinformatiques dans le domaine de l’ARN.

Nous avons effectué une estimation du niveau et la stabilité des transcrits sur l’ensemble du génome en utilisant des micropuces ADN. Dans ces expériences, les souches exprimant la RNase E cytoplasmique ou étant interrompues pour les gènes codant CsrA et CsrD ont été cultivées en culture discontinue ou continue. CsrD est une protéine membranaire qui agit de concert avec la RNase E pour réguler la stabilité de CsrB et CsrC, qui sont de petits ARN impliqués dans la régulation du stockage du carbone. CsrA est une protéine fixant les ARN, qui interagit avec CsrB, CsrC et les ARNm pour contrôler la traduction et la stabilité d’un grand régulon d’ARNm. Dans les analyses par micropuces, le niveau et la stabilité des transcrits ont été déterminés pour environ 2000 gènes. Notre publication de 2016 dans Science Reports présente les résultats d’une analyse du niveau de transcrits et de stabilité des ARNm de souches dans lesquelles les gènes codant CsrA et CsrD ont été interrompus. Une découverte clé de ce travail est que CsrA est un régulateur positif global de la stabilité des ARNm. Ce résultat suggère que la fixation des ARNm par CsrA pourrait avoir un rôle général dans la formation des mRNPs (complexes ribonucléoprotéiques ARNm) qui sont importants pour la traduction et la stabilité. Actuellement, un plus grand ensemble de souches et de conditions sont sondées pour déterminer le niveau et la stabilité des ARNm par des approches de séquençage à haut débit. Cette analyse inclut les échantillons ARNs qui ont été précédemment analysés par micropuces à ADN comme contrôle des analyses de séquençage à haut débit. Les résultats attendus incluent une cartographie globale des sites de clivage de la RNase E avec une résolution au niveau du nucléotide dans les souches sauvages et mutées.

La stabilité des ARNm chez les bactéries est déterminée en utilisant des protocoles dans lesquels la transcription est inhibée par la rifampicine et le niveau des ARNm est mesuré au cours du temps après addition de la drogue pour définir le taux de dégradation. Historiquement, les niveaux de transcrits ont été déterminés pour un ARNm particulier par Northern blot. Plus récemment, une approche sur l’ensemble du génome (stabilome) a été développée en préparant de l’ADNc à partir de l’ARN total et en l’hybridant à des micropuces à ADN. Ce protocole a été utilisé de façon routinière pour déterminer avec précision le niveau et le taux de dégradation de milliers de transcrits dans une seule expérience. Un avantage de ce protocole est qu’il ne nécessite pas de normalisation avec un standard interne. Au cours des cinq dernières années, les micropuces ont été supplantées par des analyses où l’ADNc généré à partir de l’ARN est analysé par séquençage à haut débit. Bien que plus performant que les micropuces à ADN parce qu’il permet une cartographie à l’échelle du nucléotide, la normalisation des lectures de séquençage à haut débit pour déterminer précisément le niveau des transcrits est un défi technique. Nous sommes au milieu d’une analyse à grande échelle visant à déterminer les stabilomes par séquençage à haut débit. Dès qu’un pipeline pour cartographier les lectures et pour normaliser les standards internes sera validé, nous porterons alors notre attention sur les questions biologiques qui ont motivé ce projet, nommément, quel est le rôle physiologique de l’association de la RNase E à la membrane cytoplasmique interne et comment l’association de la RNase E à la membrane interagit avec le système CSR.

Esquerré et al. (2016) The Csr system regulates genome-wide mRNA stability and transcription and thus gene expression in Escherichia coli. Sci Rep 6: 25057.

La RNase E, enzyme essentielle chez Escherichia coli, joue un rôle central dans le métabolisme des ARNs. Elle exerce ses fonctions au sein d'un gros complexe macromoléculaire appelé dégradosome d'ARN. En 2008, le groupe d'A.J. Carpousis (coordinateur) a publié des travaux démontrant que la RNase E est localisée à la périphérie de la cellule et est liée à la membrane cytoplasmique interne via une "Membrane Targeting Sequence" (MTS). La localisation de la RNase E est nécessaire à une croissance cellulaire normale. La croissance ralentie de la souche rne-delta-MTS suggère une altération de l'activité de la RNase E dans la cellule, qui pourrait impliquer l'accessibilité à ses substrats ou des interactions avec d'autres machineries liées à la membrane. Le but de notre projet est d'explorer le rôle physiologique de la localisation de la RNase E à la membrane cytoplasmique.
Durant la dernière décennie, l'utilisation de la microscopie à fluorescence pour localiser les machineries bactériennes impliquées dans la transcription, la traduction, la maturation et la dégradation des ARNs a remis en question le dogme selon lequel ces processus se dérouleraient dans une "soupe" aqueuse de macromolécules diffusant librement. En dépit de l'absence de compartiments/organelles internes, les différentes machineries sont séparées dans l'espace intracellulaire bactérien. L'ARN polymérase est associée au nucléoïde au centre de la cellule, les polyribosomes qui diffusent librement sont localisés dans l'espace cytoplasmique entre le nucléoïde et la membrane interne, et les acteurs majeurs de la maturation et de la dégradation des ARNs sont retrouvés au niveau de la membrane interne.
Les corollaires à la séparation spatiale des machineries de transcription et dégradation sont que la dégradation de l'ARN serait initiée au niveau de la membrane interne et que les étapes clés de la maturation des ARNs de transfert et ribosomiques se dérouleraient également à ce niveau. Notre hypothèse de travail est que la localisation de la RNase E à la membrane limite ses interactions destructives avec les ARNs fonctionnels. Nous nous focaliserons principalement sur l'influence de la localisation membranaire de la RNase E et sur l'action des ARNs régulateurs non codants, mais ce travail renforcera également notre compréhension de la maturation et de la" surveillance" des ARNs.
Des approches systématiques seront utilisées pour décrypter les fonctions régulatrices globales de la RNase E dans le profil d'expression génomique, dans la stabilité de chaque transcrit cellulaire, et dans les évènements de maturation au niveau du transcriptome entier. Notre stratégie consistera en la production de données avec une résolution à l'échelle du nucléotide. Les cibles directes de la RNase E localisée à la membrane ou déplacée dans la cytoplasme seront cartographiées. La comparaison de ces deux banques de données fournira des informations quant à l'accessibilité des substrats selon la localisation intracellulaire de la RNase E. La souche rne-delta-MTS sera caractérisée au niveau moléculaire. Le rôle physiologique de la localisation de la RNase E sera étudié par une approche génétique classique consistant à rechercher des suppresseurs du défaut de croissance de la souche rne-delta-MTS. Ce travail aura un impact majeur sur notre compréhension de l'organisation spatiale de la cellule bactérienne en terme de maturation, surveillance et maturation des ARNs.
L'expertise complémentaire de chaque partenaire est essentielle à l'aboutissement du projet. Le partenaire 1, l'équipe d'A.J. Carpousis, possède une grande expérience dans le domaine de la dégradation des ARNm bactériens et fût à l'origine de la découverte. Le partenaire 2, l'équipe de M. Cocaign-Bousquet, a une grande expertise dans les approches systématiques permettant de décrypter la physiologie et le métabolisme bactériens. Le partenaire 3, l'équipe de C. Gaspin, est fort de son expertise en études bioinformatiques dans le domaine des ARNs.