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Blanc - SVSE 5 - Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Edition 2013


Céram-Os


Fonctionnalisation biologique de céramiques poreuses en hydroxyapatite silicatée pour l'ingénierie tissulaire osseuse

Développement d'une nouvelle génération d'implants poreux biocéramiques phosphocalciques fonctionnalisés, possédant des propriétés ostéoinductives, pour l’ingénierie tissulaire osseuse
Le projet Céram-Os, d’ingénierie des tissus osseux, porte sur le développement d’une nouvelle génération de biocéramiques poreuses phosphocalciques fonctionnalisées et ostéoinductrices, capables de préserver le volume et la forme à restaurer, de guider et activer la repousse osseuse et l’invasion vasculaire. Ces dispositifs céramiques implantables apporteront une solution alternative adaptée aux autogreffes et implants métalliques pour la réparation et la restauration de grand défauts osseux.

Fonctionnalisation biologique de céramiques en hydroxyapatite phosphocalcique silicatée par une séquence peptidique de la protéine recombinante humaine morphogénétique osseuse 2 (rh-BMP2)
L'objectif global du projet Céram-Os est d'élaborer des dispositifs céramiques poreux en hydroxyapatite silicatée fonctionnalisés par une séquence peptidique (résidus 73-92) de la protéine rh-BMP2 afin d'améliorer la bioactivité des implants, i.e. stimuler à la fois l'ostéogenèse et l’angiogenèse.
Notre stratégie est basée sur le potentiel ostéogénique et vascologénique de la protéine rh-BMP2 associé aux propriétés d'ostéoconduction des céramiques phosphocalciques macroporeuses. Les implants céramiques poreux fourniront le support structural, l'intégrité et la tenue mécanique au dispositif avec une rigidité similaire à celle de l'os. La fonctionnalisation apportera la capacité à relarguer le peptide BMP2 actif à une vitesse adaptée vis-à-vis de la néoformation osseuse pour la colonisation de l'implant.

Les principales difficultés du projet sont les suivantes :
(i) Liaison covalente contrôlée du peptide à la surface de la céramique. Des études préliminaires ont déjà été effectuées et deux protocoles alternatifs de greffage sont envisagés dans le projet.
(ii) Une trop faible bioactivité du peptide (73-92) de laprotéine rh_BMP2. Dans ce cas la protéine rh-BMP2 complète sera directement utilisée en remplacement du peptide.
(iii) Contrôle de la libération du peptide (ou de la protéine) dans le temps. Une originalité du projet est d'immobiliser le peptide sur la surface de la céramique via un intermédiaire bio-organique clivable (dégradable) . La dose réelle du peptide libéré en fonction du temps sera évaluée précisément. La connaissance de ce comportement est un facteur clé pour ajuster la dose de peptide à l'application, éviter le surdosage de ce facteur de croissance, et donc pour le succès du projet et le développement de dispositifs implantables efficaces.
La réponse biologique in vivo sera considérée comme le principal facteur d'évaluer des performances de ces nouveaux dispositifs.

Greffage covalent d'une biomolécule active à la surface de céramiques denses via un intermédiaire organique clivable pour un relargage controlé de la biomolécule
Le projet Céram-Os est une recherche fondamentale multidisciplinaire. Elle implique quatre partenaires académiques complémentaires dans les domaines des procédés céramiques, de la chimie bioorganique, de la biologie cellulaire et de la chirurgie réparatrice.
La participation chronologique des partenaires est destinée à mettre en place une nouvelle méthode pour la régénération du tissu osseux. Le projet comprend l'élaboration de matériaux inorganique-organique, la caractérisation physico-chimique de ces matériaux ainsi que leur évaluation biologique in vitro et in vivo.
Le projet est divisé en cinq tâches thématiques principales. Deux tâches supplémentaires sont spécifiquement consacrées à la coordination du projet et à la valorisation des résultats scientifiques, qui comprend une prospection industrielle en vue du développement ultérieur des dispositifs implantables pour des applications en ingénierie du tissu osseux.

Des poudres d'hydroxyapatite carbo-silicatée (CSIHA) et d'hydroxyapatite silicatée (SiHA) ont été synthétisés par précipitation en milieu aqueux. Des pastilles céramiques plates et denses ont été produites par pressage isostatique à froid suivi d'un frittage. Elles ont été utilisées pour établir et caractériser le protocole de fonctionnalisation de la surface des céramiques. Ces substrats plats seront également utilisés pour évaluer les propriétés biologiques de la céramique fonctionnalisée. Cette partie du programme comprendra l'évaluation de la stérilisation en vue de d'expérimentation animale qui sera menée ultérieurement.

Résultats

Les travaux réalisés au cours des 18 premiers mois du projet ont essentiellement porté sur la synthèse de poudres d’apatite carbo-silicatée (CSiHA) et silicatée (SiHA), l’élaboration des substrats céramiques denses, ainsi que sur la mise au point d’un protocole d’immobilisation du peptide (73-92) de la protéine rh-BMP2 à la surface de ces substrats. La stratégie spécifique de greffage par silanisation, réactions de couplage spécifiques et chimie-click a permis d’aboutir à un greffage covalent du peptide en faible densité (absence de film polymère à la surface de la céramique) sur la céramique SiHA. Les résultats obtenus sur la fonctionnalisation et la caractérisation des céramiques denses fonctionnalisées ont fait l’objet d’une communication orale en congrès international.
Parallèlement à ces travaux, l’étude de la bioactivité de la séquence peptidique (73-92) de la rh-BMP2 comparée à celle de la protéine complète a été réalisée. Les résultats obtenus selon plusieurs protocoles avec deux lignées cellulaires montrent que contrairement à la protéine complète, le peptide n’induit aucune des 2 voies de signalisation (activité de la phosphatase alcaline via la voie de p38/ MAPK et induction de « BMP responsive elements » via la voie des Smads) classiquement induite par la rh-BMP2.

Perspectives

Les travaux engagés pour la suite du projet restent globalement identiques à ceux initialement planifiés. L’utilisation du peptide (73-92) est abandonnée, celui-ci n'ayant pas donné de résultat positif concernant sa bioactivité, Seule la protéine complète rh-BMP2 sera mise en œuvre dans la suite des travaux conformément à la solution de replis prévue initialement. Les principales actions vont porter sur l’adaptation du protocole de greffage à la protéine complète. Des protocoles d’étude de la cinétique de relargage in vitro de la protéine sont actuellement en cours de mise en place.
L'étude in vivo des biocéramiques fonctionnalisées par la protéine rh-BMP2 sera programmées dans un second temps. Elles seront réalisées par implantation sous-cutanée chez le rat. Les animaux seront traités dans le respect des directives Européennes en matière de soins et d'utilisation des animaux de laboratoire. Les protocoles d’expérimentation animale détaillés seront au préalable soumis pour autorisation auprès du Ministère de la Recherche via un comité d'éthique.
Dans cette optique, des implants céramiques poreux, mis en forme par un procédé de réplique de modèle puis frittés, seront fonctionnalisés par la protéine et stérilisés avant implantation.

Productions scientifiques et brevets

Communication orale :
Elaboration of osteoinductive phosphocalcic bioceramics for bone tissue engineering
E. Poli, C. Damia, V. Chaleix, V. Sol, D. Marchat, N. Douard, D. Logeart, J. Brie, E. Champion
14th International Conference and Exhibition of the European Ceramic Society, EcerS 2015, Tolède (Espagne), 23-25 Juin 2015

Partenaires

Laboratoire public

CIS Centre Ingénierie et Santé , ENSM Saint-Etienne, CNRS, UMR 5307

Laboratoire public

LCSN Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles, Université de Limoges, EA 1069

SPCTS Science des Procédés Céramiques et de Traitements de Surface, Université de Limoges, CNRS, UMR 7315

Aide de l'ANR 414 985 euros
Début et durée du projet scientifique janvier 2014 - 42 mois

Résumé de soumission

La réparation de grandes pertes de substance osseuse résultant de traumatismes, maladies, etc, est une difficulté clinique importante. Les solutions actuelles font appel aux autogreffes, aux allogreffes ou aux biomatériaux synthétiques mais aucune d’elles n’est réellement satisfaisante.
Les céramiques en hydroxyapatite phosphocalcique Ca10(PO4)6(OH)2 -HAC- sont employées comme substituts osseux synthétiques depuis plus de 30 ans. Leurs propriétés biologiques (i.e. ostéoconduction) ont conduit à l’implantation de pièces poreuses dont le réseau de pores interconnectés est colonisé par des tissus osseux néoformés. Cependant, la formation naturelle de ces tissus est limitée à de petites dimensions (jusqu’à environ 1 cm de l’apposition osseuse). Elle doit donc être stimulée biologiquement pour étendre les applications des HAC à la réparation de grands défauts osseux.

Le projet Céram-Os, d’ingénierie des tissus osseux, porte sur le développement d’une nouvelle génération de céramiques implantables ostéoinductrices, capables de préserver le volume et la forme à restaurer, de guider et activer la repousse osseuse et l’invasion vasculaire. Il implique quatre partenaires académiques complémentaires dans une recherche fondamentale multidisciplinaire sur les domaines des procédés céramiques, de la chimie bio-organique, de la biologie cellulaire et de la chirurgie. La stratégie est de fonctionnaliser les HAC par une séquence peptidique de la protéine morphogénétique osseuse humaine recombinante (rh-BMP2) qui induit l’ostéogénèse et stimule la prolifération de cellules periostéales. Le peptide sera immobilisé à la surface des céramiques via un lien organique dégradable permettant la libération contrôlée de la molécule active.

Le projet comporte quatre objectifs principaux :
(i) Fabrication de céramiques en hydroxyapatite partiellement substituée par du silicium Ca10(PO4)5.6(SiO4)0.4(OH)1.6 (SiHAC).
La poudre sera précipitée en voie aqueuse. Les pièces seront mises en forme par réplique puis consolidées par frittage. Le silicium substitué au phosphore dans l’hydroxyapatite fournira des sites préférentiels pour le greffage du peptide via des liaisons Si-O-Si.
(ii) Biofonctionnalisation des biocéramiques
La fonctionnalisation sera réalisée par silanisation de la surface des céramiques. L’organosilane sera couplé à un agent de liaison lui-même lié à un polymère dégradable supportant le peptide.
(iii) Evaluation in vitro de la bioactivité des SiHAC fonctionnalisées et des caractéristiques de libération du peptide.
L’activité biologique du peptide immobilisé sera étudiée avec deux lignées cellulaires complémentaires réactives à la BMP (C3H10-BRE-Luc et C2C12). Sa cinétique de libération et sa bioactivité seront évaluées en milieu de culture. Ses évaluations incluront la validation du protocole de stérilisation.
(iv) Evaluation biologique in vivo des dispositifs poreux fonctionnalisés.
Le potentiel ostéogénique des dispositifs fonctionnalisés et la relation dose-réponse du peptide seront évalués après implantation sous-cutanée chez le rat. La colonisation osseuse des implants préparés dans différentes conditions (e.g. HAC seule, fonctionnalisée par adsorption de rh-BMP2 et fonctionnalisée par greffage du peptide) sera quantifiée par histomorphométrie et micro-CT.

Notre stratégie repose sur le potentiel ostéogénique et vasculogénique de la protéine rh-BMP2 associé aux propriétés ostéoconductrices des HAC macroporeuses. Outre le support (taille et forme), la céramique fournira la stabilité et la rigidité mécaniques nécessaires pour une bonne reconstruction de l’os. La biofonctionnalisation permettra la libération contrôlée du peptide (vitesse, dose).

Le développement de cette nouvelle génération de biocéramiques ostéoinductrices constituera une avancée majeure vers les matériaux « intelligents » pour une ostéointégration accrue des implants et fournira une solution adaptée pour le comblement et la réparation de grands défauts osseux.

 

Programme ANR : Blanc - SVSE 5 - Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5) 2013

Référence projet : ANR-13-BSV5-0002

Coordinateur du projet :
Monsieur Eric CHAMPION (Science des Procédés Céramiques et de Traitements de Surface, Université de Limoges, CNRS, UMR 7315)
eric.champion@nullunilim.fr

 

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