Identification et Visualisation des Mécanismes Permettant l’Acquisition d’un Phénotype Invasif chez les Mycobactéries Pathogènes à Croissance Rapide – DIMYVIR

Deux éléments importants dans la comparaison lisse (S) – rugueuse (R) sont apparus, notamment par l’étude transcriptomique de la transition S/R. Le gène lsr2, d’une part, est induit dans la forme R comparativement à la forme S. Lsr2 est un régulateur pléiotropique impliqué potentiellement dans la régulation de la synthèse de glycopeptidolipides pariétaux responsable de l’aspect lisse de M. abscessus. Par ailleurs, une région spécifique de M. abscessus, composée de deux gènes (MAB_4690c (pstA) et 4691c) serait impliqué dans la synthèse d’autres composés glycolipidiques de nature inconnue. Nous avons ainsi générés des mutants dans les gènes lsr2 et pstA et analysé la virulence de ces mutants dans l'embryon de zebrafish et dans la souris. Une banque transpositionnelle de type Tn5 a également été réalisée dans le variant R. Sur base de l'aspect mophologique des colonies, 7 mutants ont été sélectionnés et analysés en fonction de leur capacité à former des biofilms et des cordes. Ces mêmes mutants ont été rendus fluorescents puis injectés par voie intraveineuse dans l'embryon de zebrafish. Leur capacité à coloniser les poumons de la souris a également été étudiée.
Des analyses transcriptomiques par qRT-PCR, ainsi que l’utilisation de lignées transgéniques ainsi que la technologie antisens ont été utilisées pour déterminer la contribution du système immunitaire inné et le rôle de l’inflammation au cours de l’infectieux. Enfin, un nouveau développement technologique a été mis au point afin d’évaluer la charge bactérienne des différents mutants au cours de l’infection dans le zebrafish. Il est basé sur la mesure de l’intensité de la fluorescence émise par les bactéries fluorescentes qui reflète la charge bactérienne dans l’embryon. Le grand avantage de cette méthode est qu’elle ne nécessite pas de sacrifier l’animal, ce qui permet d’étudier la dynamique de la croissance bactérienne au cours du temps et dans un même individu.

Parmis les 7 mutants de paroi sélectionnés, deux d'entre eux, se sont révélés être particulièrement atténués dans ce modèle par rapport à la souche parentale R. L'un d'entre eux, 1C3, (renfermant le Tn5 dans le Mabs_4024c codant une monooxygénase potentielle) possède toujours la faculté de produire des cordes, tandis que 22D1 (renfermant le Tn5 dans le Mabs_3035 impliqué dans la biosynthèse des phénazines) ne produit plus de cordes. L'analyse de la composition de leur paroi de ces mutants est actuellement en cours d'étude.
Concernant lsr2, nos résultats montrent qu'une mutation dans lsr2 chez M. abscessus R abolit complètement la virulence de cette souche, la formation de cordes et de granulomes dans le poisson zèbre. En ce qui concerne pstA, le mutant ne tue plus la souris à des doses de 108 CFU/ml comparativement à la souche R, atténuation retrouvée également le modèle poisson zèbre.
Les résultats les plus marquants de ce début de projet résultent de l’obtention pour la première fois de mutants R dépourvus de «cording» et qui s’avèrent particulièrement atténués dans deux modèles d’infection complémentaires. Ils permettent d’étayer nos hypothèses initiales reliant la capacité de M. abscessus à produire des cordes et la virulence de cette mycobactérie et ouvrent d’ores et déjà vers de nouvelles possibilités de contrôle de l’infection.
L’analyse combinant qRT-PCR et différentes lignées transgéniques a révélé que le morphotype R induit une forte réponse pro-inflammatoire caractérisée par une production intense de TNFa par les macrophages et d’un recrutement massif de neutrophiles. Le rôle du TNFa a été confirmé grâce à des embryons dépourvus de TNF-récepteurs fonctionnels. Ces derniers présentent une exacerbation du «cording» entrainant le développement rapide d’abcès et la mort précoce des embryons. Ces résultats confirment donc l'importance de la réponse pro-inflammatoire et soulignent également le rôle protecteur du TNF face à ce pathogène.

Les perspectives et retombées de DIMYVIR sont multiples. D'un point de vue fondamental, ce projet vise à établie des concepts nouveaux en mettant en lumière de nouveaux mécanismes impliqués dans la régulation, la virulence et la physiopathologie induite par les variant rugueux de M. abscessus. La description des événements impliqués dans la transition S vers R laisse déjà entrevoir un processus évolutif permettant à une mycobactérie environnementale de devenir pathogène pour l'homme. Ce projet permettra d’identifier et de décrire de nouveaux déterminants de virulence spécifiques à l’établissement des stades chroniques et persistants des mycobactéries atypiques dans les poumons. Nos premiers résultats soulignent d’ores et déjà la possibilité de pouvoir interférer ou d'empêcher la transition S/R pour pouvoir contrôler le processus infectieux. D’un point de vue translationnel, DIMYVIR pourrait à terme déboucher sur le développement de nouvelles molécules innovantes capables d’interférer avec la commutation S/R, particulièrement justifié dans le contexte de résistance extrême de M. abscessus aux antibiotiques.

1. A. Bernut, C.M. Dupont, A. Sahuquet, J.L. Herrmann, G. Lutfalla, and L. Kremer. 2015. Deciphering and imaging pathogenesis and cording of Mycobacterium abscessus in zebrafish embryos. J. Vis. Exp. In Press.

2. V. Dubée, A. Bernut, M. Cortes, T. Lesne, D. Dorchene, A-L. Lefebvre, J-E. Hugonnet, L. Gutmann, J-L. Mainardi, J-L. Herrmann, J-L. Gaillard, L. Kremer, and M. Arthur. 2014. ß-lactamase inhibition by avibactam in Mycobacterium abscessus. J. Antimicrobial. Chemother. 70: 1051-1058.

3. A. Bernut, V. Le Moigne, T. Lesne, G. Lutfalla, J-L. Herrmann and L. Kremer. 2014. In vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium abscessus using the embryonic zebrafish test system. Antimicrobial Agents Chemother. 58: 4054-4063.

4. A. Bernut, G. Lutfalla, and L. Kremer. 2015. Regards au travers du Danio pour mieux comprendre les interactions hôtes/pathogènes. Med. Sci. In Press.

L’impact des pathologies pulmonaires chroniques sur la santé est actuellement méconnu. Parmi celles-ci, la broncho-pneumopathie chronique obstructive représentera en 2020 la 3ème cause de mortalité dans le monde. Un processus inflammatoire suite à une agression physique, chimique ou infectieuse précède toujours la chronicité irréversible de ces pathologies. Nous proposons que les mycobactéries environnementales jouent un rôle primordial dans ce processus inflammatoire et pathologique. Parmi celles-ci, Mycobacterium abscessus est l’espèce à croissance rapide la plus fréquemment associée aux infections pulmonaires et iatrogènes. Elle provoque une pathologie pulmonaire caractérisée par des formes graves, très inflammatoires, à l’issue d’un processus infectieux lent et chronique, et suivi d’une persistance. Les patients atteints de mucoviscidose sont particulièrement vulnérables à cette bactérie qui est extrêmement résistante aux antibiotiques, conduisant à des impasses thérapeutiques.
M. abscessus peut exister sous deux formes: lisse (S) et rugueuse (R), selon la présence ou l’absence respective de glycopeptidolipides (GPL), glycolipides associés à la paroi du bacille. Ces GPL participent à la motilité et à la capacité des mycobactéries à former des biofilms, deux caractéristiques importantes de la colonisation bactérienne, notamment dans la mucoviscidose. Une corrélation entre le morphotype R capable de produire des structures morphologiques visibles en microscopie dites en «corde» et la virulence a été établie. Ainsi, la propension naturelle de M. abscessus à commuter d’un phénotype S vers un R permettrait la transition d’un statut colonisant vers une forme invasive et pathogène. Dès lors, les événements responsables du changement de S à R seraient centraux dans la pathologie induite par M. abscessus. Notre question fondamentale est de comprendre si M. abscessus isolée à partir d’expectorations pulmonaires représente une forme colonisante ou une forme virulente et invasive. Les mécanismes favorisant toute colonisation pulmonaire par M. abscessus et qui mèneraient inévitablement à une agression et inflammation chronique demeurent inconnus. Ainsi, ce projet est centré sur le décryptage des mécanismes spécifiques et l’analyse des avantages conférés par cette transition S/R in vivo, en utilisant des approches novatrices d’analyse de mutants par l’analyse spectrale «High resolution Magic Angle Spinning NMR» et des modèles animaux non encore décrits avec cette bactérie.
Nos données de transcriptomique et de séquençage d’ARN nous donnent accès à une description précise des transcriptomes des variants S et R. Le rôle et la contribution de plusieurs gènes, sélectionnés par la transcriptomique, ou identifiés via le criblage d’une banque de mutants R par transposition et déficients dans la formation de cordes, seront évalués en générant des mutants définis. Ces derniers seront analysés en insistant tout particulièrement sur i) la composition (glyco)lipidique de leur paroi et ii) l’analyse de leur virulence respective dans des souris et des embryons de poisson-zèbre infectés. L’infection de ces mutants fera l’objet d’un suivi spatio-temporel, grâce à la transparence optique des embryons. La participation/recrutement des macrophages et neutrophiles et le rôle de l’inflammation en réponse à l’infection seront également étudiés.
Ce projet permettra d’identifier et de décrire de nouveaux déterminants de virulence spécifiques à l’établissement des stades chroniques et persistants des mycobactéries atypiques dans les poumons. L’identification des verrous moléculaires de la commutation S vers R permettra de comprendre comment une mycobactérie environnementale évolue vers un comportement pathogène dans l’hôte. Il pourra déboucher sur le développement de nouvelles molécules innovantes capables d’interférer avec la commutation S/R, ce qui est particulièrement justifié dans le contexte de résistance extrême de M. abscessus aux antibiotiques.