Intégrines alphav des cellules musculaires lisses vasculaires : liens mécanistiques entre rigidité artérielle et génération de thrombine intrapariétale – EVASION

Le projet est organisé en 4 lots de tâches complémentaires :
(i) génération de souris transgéniques invalidées ou surexprimant de façon inductible la sous-unité alpha v dans les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLv) ou les cellules endothéliales
(ii) identification du rôle de la voie de l’intégrine alpha v des CMLv dans l’élasticité artérielle et la génération de thrombine intrapariétale en étudiant, à l’état de base ou après un traitement hypertensif, le phénotype cardiovasculaire et de coagulation des souris mutantes alpha v, en analysant les modifications cardiaques, cérébrales et vasculaires par tomographie par émission de positrons et la distribution de l’intégrine alpha v beta 3 et de la thrombine par imagerie, et en caractérisant l’élasticité des CMLv.
(iii) analyse de l’impact de la différenciation des CMLv sur la rigidité artérielle et la coagulation en évaluant les effets de l’invalidation ou de la surexpression de l’intégrine alpha v sur la différenciation des CMLv régulée par le facteur de transcription SRF, et en étudiant les liens entre l’activité SRF et l’intégrine alpha v dans des modèles murins transgéniques pour SRF.
(iv) confirmation des mécanismes identifiés dans des tissus aortiques humains et évaluation de la pertinence du ciblage thérapeutique de la voie alpha v beta 3 dans nos modèles murins.

Dans le modèle de la souris invalidée de façon conditionnelle à l’âge adulte pour la sous-unité alpha v dans les cellules musculaires lisses, la génération de thrombine est diminuée en sang total, plasma riche ou pauvre en plaquettes. L’addition d’anneaux aortiques au plasma augmente la génération de thrombine pour les souris contrôles mais pas pour les souris invalidées. La formation d’un thrombus carotidien est retardée chez la souris invalidée, ce qui confirme le rôle de l’intégrine alpha v beta 3 dans la génération de thrombine à la surface des cellules musculaires lisses.
L’élasticité artérielle de la souris invalidée à l’état basal n’est pas modifiée malgré une baisse modérée de la pression artérielle. En réponse à l’angiotensine II, l’augmentation de collagène dans la média est moins importante chez les souris invalidées. Ces résultats suggèrent que la fibrose vasculaire est aussi dépendante de cette intégrine ce qui représenterait une nouvelle perspective dans le traitement de la fibrose artérielle.
Des coupes d’immunohistochimie de plaques d’athérosclérose à différents stades montrent une présence plus forte de l’intégrine alpha v beta 3 dans les plaques par rapport à l’aorte saine. Nous avons mis en évidence une faible génération de thrombine endogène dépendante en partie de cette intégrine à la surface des cellules musculaires lisses issues de la plaque.
Des peptides contenant une séquence RGD, couplés à des groupes prosthétiques glucidiques marqués au fluor 18 ont été développés avec les chimistes de l’UMR CNRS 7565 et le GIE Nancyclotep (Nancy) pour l’analyse de la voie de l’intégrine alpha v beta 3 en tomographie par émission de positons.

Les prochaines étapes programmées sont :
1) Identifier les acteurs moléculaires responsables des modifications de la coagulation des souris invalidées
2) Comprendre les mécanismes de contrôle de la fibrose artérielle en rapport avec cette intégrine.
3) Etudier la fonctionnalité du complexe intégrine alpha v beta 3-prothrombine des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLv) dans l’athérosclérose et préciser si la génération de thrombine intervient à des concentrations suffisantes pour exercer des effets prothrombotiques ou prolifératifs
4) Développer de nouveaux traceurs utilisant le couplage de peptides contenant une séquence RGD au NOGADA et au gallium-68
5) Caractériser la rigidité cellulaire des CMLv par microscopie à force atomique en mesurant des forces d’interaction entre protéines de la matrice extracellulaire (incluant la prothrombine) et l’intégrine alpha v beta 3 des CMLv des souris mutantes et contrôles ou des CMLv humaines mises en culture à partir de prélèvements à différents stades d’athérosclérose
Des souris avec hyperexpression de la sous-unité alpha v dans les CMLv, ainsi que des modèles « gain et perte de fonction » de cette sous-unité dans les cellules endothéliales sont en cours de construction. Ces lignées seront croisées avec (i) des souris invalidées ou surexprimant le facteur de réponse au sérum afin d’étudier le rôle de la différentiation des CMLv et (ii) des souris transgéniques pour les différentes sous-unités beta afin de définir les partenaires liés à la sous-unité alpha v responsables de ces phénotypes.
Grâce à la confrontation de ces différentes approches in vivo, in vitro et translationnelles nous espérons définir le rôle de l’intégrine alpha v beta 3 et de sa signalisation dans la fibrose vasculaire, la rigidité et l’athérothrombose.

Lamandé-Langle S, Collet C, Hensienne R, Vala C, Chrétien F, Chapleur Y, Mohamadi A, Lacolley P, Regnault V. 'Click' glycosylation of peptides through cysteine propargylation and CuAAC. Bioorg Med Chem. 2014;22:6672-83.

Ait Aissa K, Lagrange J, Mohamadi A, Louis H, Houppert B, Challande P, Wahl D, Lacolley P, Regnault V. Vascular smooth muscle cells are responsible for a prothrombotic phenotype of spontaneously hypertensive rat arteries. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2015;35:930-7.

Mohamadi A, Li Z, Louis H, Bourhim M, Lacolley P, Regnault V. Conditional inactivation of integrin alpha v subunit in vascular smooth muscle cells decreases thrombin generation in vessels and blood. XXVth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Toronto, 20-25 juin 2015. In : J Thromb Haemost, 2015;13(suppl 2):307.

Didelot M, Belozertseva E, Li Z, Mohamadi A, Malikov S, Louis H, Michel JB, Lacolley P, Regnault V. Expression de l’intégrine av au cours du développement de l’athérosclérose. Congrès de la Nouvelle Société Française d’Athérosclérose (NSFA), Biarritz, 25-27 juin 2015.

Collet C, Maskali F, Poussier S, Mohamadi A, Regnault V, Lacolley P, Chapleur Y, Marie PY, Karcher G, Lamandé-Langle S. Development of [18F]Fluoro-sugar based prosthetic groups for the PET imaging of radiolabel peptides. 28th Annual European Association of Nuclear Medicine (EANM) Congress, Hamburg, 10-14 octobre 2015.

Belozertseva E, Didelot M, Mohamadi A, Louis H, Li Z, Michel JB, Regnault V and Lacolley P. Conditional inactivation of integrin av subunit in vascular smooth muscle cells regulates fibrosis in vessels. 19th annual meeting of the European Council for Cardiovascular Research, Poiano, 23-25 octobre 2015.

La rigidité artérielle et l’hypercoagulabilité liée à l’athérosclérose augmentent le risque d’accident vasculaire cérébral. Les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLv) jouent un rôle clé dans la pathologie athéromateuse. Ces cellules possèdent une grande capacité d’adaptation en reprogrammant leur profil d’expression génique en réponse à des stimuli aigus, principalement par des interactions ligands-récepteurs. Une augmentation de la rigidité artérielle et de la perméabilité endothéliale influencent la convection de substances solubles du sang vers la paroi, ce qui conduit à une activation des intégrines.
L’activation de la mécanotransduction, l’activation plaquettaire induite par une désendothélialisation et l’augmentation d’expression du facteur tissulaire ont été proposés comme mécanismes mais ne peuvent pas expliquer toutes les interactions entre coagulation et paroi, en particulier dans la rigidité artérielle liée au vieillissement. L’intégrine avb3 est fortement exprimée par les CMLv où elle lie la vitronectine et toutes les protéines de la matrice extracellulaire qui possèdent un motif Arg-Gly-Asp accessible. L’intégrine avb3 est impliquée dans la réponse proliférative et la prévention de l’apoptose des CMLv induite par des forces mécaniques. L’intégrine avb3 sert aussi de récepteur pour la prothrombine sur les CMLv et l’augmentation de génération de thrombine par les CMLv en réponse aux déformations mécaniques est abolie par des inhibiteurs d’avb3.
L’objectif principal du projet EVASION est d’acquérir une meilleure compréhension du rôle des intégrines av des CMLv dans les liens mécanistiques entre rigidité artérielle et génération de thrombine intrapariétale. Le projet est organisé en 4 lots de tâches complémentaires :
(i) génération de souris transgéniques invalidées ou surexprimant de façon inductible la sous-unité av dans les CMLv ou les cellules endothéliales
(ii) identification du rôle de la voie de l’intégrine av des CMLv dans l’élasticité artérielle et la génération de thrombine intrapariétale en étudiant, à l’état de base ou après un traitement hypertensif, le phénotype cardiovasculaire et de coagulation des souris mutantes av, en analysant les modifications cardiaques, cérébrales et vasculaires par tomographie par émission de positrons et la distribution de l’intégrine avb3 et de la thrombine par imagerie, et en caractérisant l’élasticité des CMLv
(iii) analyse de l’impact de la différenciation des CMLv sur la rigidité artérielle et la coagulation en évaluant les effets de l’invalidation ou de la surexpression de l’intégrine av sur la différenciation des CMLv régulée par le facteur de transcription SRF, et en étudiant les liens entre l’activité SRF et l’intégrine av dans des modèles murins transgéniques pour SRF
(iv) confirmation des mécanismes identifiés dans des tissus aortiques humains et évaluation de la pertinence du ciblage thérapeutique de la voie avb3 dans nos modèles murins.
Le projet EVASION repose sur la complémentarité d’unités mixtes Inserm (UMR_S 1116 et 698) et CNRS (UMR 7588) et d’une équipe de recherche de Paris 6 (UR4), qui va de la recherche fondamentale comprenant la microscopie à force atomique à la physiopathologie et l’imagerie clinique. Ce projet est à fort potentiel de valorisation, attesté par l’engagement de 3 sociétés (Diatecne, Synapse B.V. and Nancyclotep).
Les points forts d’EVASION seront (i) l’approche intégrative, de la souris transgénique à une intégrine, (ii) le suivi de la génération de thrombine sur des micro-tissus artériels, (iii) l’étude de la rigidité artérielle au niveau cellulaire et tissulaire, (iv) l’imagerie de la voie de l’intégrine avb3 et (v) le caractère translationnel par la mise à disposition de prélèvements artériels humains.
Ce projet devrait apporter de nouvelles approches diagnostiques et thérapeutiques pour les sujets âgés dont l’hypertension favorise l’athérosclérose, la formation d’anévrisme ou d’autres complications thromboemboliques.