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Blanc - SVSE 1 - Physiologie, physiopathologie, santé publique (Blanc SVSE 1)
Edition 2013


ShearWil


Régulation hémodynamique de l'interaction entre le facteur Willebrand et le récepteur LRP1: aspects fondamentaux et conséquences pathophysiologiques

Liaison dépendante du flux du facteur Willebrand (VWF) à LRP1
Le facteur Willebrand (VWF) est une protéine crucial en hémostase. Il est important de réguler ses taux plasmatiques pour empêcher d’une part les saignements et d’autre part les thromboses. Nous étudions le rôle du LRP1 dans la régulation des taux plasmatiques du VWF. LRP1 interagit avec le VWF par un mécanisme faisant intervenir le flux et les forces de cisaillement. We déchiffrons les bases moléculaires de l’interaction VWF-LRP1 et si des mutations modifient cette interaction.

Identification des bases moléculaires de l’interaction entre le VWF et LRP1
Nous avons identifié un nouveau récepteur impliqué dans la clairance du VWF, LRP1 (Rastegarlari et al. (2012) Blood 119:2126-34). Ce récepteur est exprimé par de très nombreuses cellules dont les macrophages, les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses et les mégacaryocytes. Au delà de son rôle en tant que récepteur de clairance, LRP1 est également capable d’induire une cascade de signalisation et son implication dans les mêmes processus pathologiques que ceux impliquant le FW a été démontrée. L’hypothèse selon laquelle le FW serait engagé dans ces processus par l’intermédiaire du récepteur LRP1 est donc particulièrement séduisante.
Il est à noter que le FW est incapable de se lier à LRP1 dans des conditions statiques mais doit au préalable être exposé à des contraintes de cisaillement (flux). Ce type d’interaction est réminiscent de l’interaction existant entre le FW et son récepteur plaquettaire la glycoprotéine Ib et s’explique par la structure multimérique complexe du FW. En conditions statiques ou de flux peu rapide, le FW adopte une conformation globulaire repliée dans laquelle certains sites d’interactions sont inaccessibles. L’exposition de la molécule à un flux rapide entraine un changement de conformation du FW vers une forme étirée capable d’interagir aves ses récepteurs.
En conséquence, le but de ce projet est d’explorer plus en détails ces aspects hémodynamiques de l’interaction entre le FW et LRP1. Trois objectifs plus spécifiques sont visés :
1: Identifier le(s) site(s) d’interaction pour LRP1 sur le FW
2: Appréhender la manière dont les mutations du FW identifiées chez des patients, modulent la liaison avec LRP1 en relation avec la pathologie de la MW
3: Déterminer comment l’interaction FW-LRP1 affecte la fonction, la viabilité et la morphologie des cellules exprimant LRP1

Notre approche est multidisciplinaire avec des techniques de biochimie et de biologie cellulaire ainsi que des modèles animaux dédiés.
Au cours de ce projet, l’interaction entre LRP1 et le VWF a été étudiée de différentes façons. D’abord, en utilisant des protéines recombinantes purifiées, nous avons réalisé des tests de liaison directe (sur plaques et en résonnance plasmonique de surface). Ensuite, nous avons utilisé des cellules exprimant ou non LRP1 (monocytes/macrophages isolés à partir de souris déficientes ou non en LRP1) et nous avons testé la liaison du VWF ou de ses variants à ces cellules par immunofluorescence (microscopie à champ large ou confocale).
Finalement, des modèles murins (déficients ou non en LRP1 au niveau des macrophages) ont été utilisés pour mesurer la pertinence physiologique de l’interaction VWF-LRP1.

Résultats

Nous avons exploré l’interaction entre les mutants de VWF et LRP1 en nous concentrant sur des mutations identifiées chez des patients atteints de maladie de Willebrand (VWD) de type 2B. Puisque les mutations VWD 2B sont localisées dans le domaine A1 du VWF, nous avons testé si ce domaine pouvait interagir avec LRP1. Effectivement, le domaine A1 mais pas les domaines A2 ou A3 peut se lier à LRP1. La liaison VWF-LRP1 est potentialisée par la mutation VWD type 2B, p.V1316M. Dans le VWF total, la présence des mutations VWD type 2B, permet une liaison spontanée du VWF à LRP1 sans flux. L’utilisation de souris déficientes en LRP1 au niveau des macrophages nous a permis d’observer que la clairance des mutants VWD type 2B est ralentie dans ces souris. Ceci suggère que le récepteur LRP1 contribue à la clairance augmentée de ces mutants.
Dans une deuxième partie du projet, nous avons observé que d’autres domaines du VWF étaient également impliqués dans l’interaction avec LRP1 (région D’D3 et domaine D4) et que des mutations dans ces domaines augmentaient la liaison à LRP1. Toutefois, bien que la clairance de ces mutants était réduite dans les souris déficientes en LRP1 au niveau des macrophages, il n’était pas possible de revenir à une cinétique d’élimination comparable aux souris contrôles. Nous avons donc conclu à l’existence d’un second récepteur. Nous avons récemment identifié un récepteur candidat qui non seulement se lie au VWF de type sauvage mais qui voit sa liaison aux mutants de VWF augmentés que ce soit en système purifié ou en système cellulaire. De plus, grâce à un modèle murin déficient pour ce nouveau récepteur, nommé Scavenger-receptor A1 (SR-A1, aussi connu sous le nom de CD204) et nous avons constaté que son rôle est pertinent in vivo puisque la clairance du VWF est significativement réduite dans les souris déficientes. Notre étude a donc permis l’identification de SR-A1 comme étant un nouveau récepteur jouant un rôle important dans la clairance du VWF.

Perspectives

Nous avons identifié des mutations du VWF qui induisent une potentialisation de l’interaction entre le VWF et LRP1 et entre le VWF et SR-A1, permettant d’expliquer pourquoi ces mutants sont éliminés plus rapidement que la protéine sauvage. Un tel mécanisme est tout à fait susceptible d’expliquer pourquoi les taux de VWF sont réduits chez les patients présentant ces mutations dans leur VWF. Nos résultats soulignent à quel point la clairance du VWF est une mécanisme complexe qui implique de multiple récepteurs.

Productions scientifiques et brevets

- Wohner N, Legendre P, Casari C, Christophe OD, Lenting PJ, Denis CV. Shear stress-independent binding of von Willebrand factor-type 2B mutants p.R1306Q and p.V1316M to LRP1 explains their increased clearance.
J Thromb Haemostas (2015) 13:815-820
- Lenting PJ, Christophe OD, Denis CV. Von Willebrand factor biosynthesis, secretion & clearance: connecting the far ends.
Blood (2015) 125:2019-2028

Partenaires

U770 Inserm Unit 770

Aide de l'ANR 239 970 euros
Début et durée du projet scientifique décembre 2013 - 42 mois

Résumé de soumission

Le rôle physiologique du système hémostatique consiste à maintenir le sang dans un état fluide tout en minimisant la perte sanguine lors d’une blessure vasculaire. Ce système est intimement lié à d’autres processus physiologiques tels que les réponses immunitaires et inflammatoires ainsi que l’angiogenèse. Un exemple de protéine hémostatique jouant un rôle dans d’autres processus est le facteur Willebrand (FW). Le FW est essentiel en hémostase comme l’illustre le syndrome hémorragique associé à un défaut fonctionnel en FW, une pathologie connus sous le nom de maladie de Willebrand (MW) et qui touche jusqu’à 1% de la population. Au cours des dernières années, il a été démontré que le FW est également impliqué dans des processus physiopathologiques variés comme l’inflammation, l’apoptose des cellules tumorales, l’hyperplasie néo-intimale et l’angiogenèse. Toutefois, les mécanismes moléculaires faisant intervenir le FW sont encore très mal connus.
Récemment, nous avons identifié un nouveau récepteur impliqué dans la clairance du VWF, LRP1 (Rastegarlari et al. (2012) Blood 119:2126-34). Ce récepteur est exprimé par de très nombreuses cellules dont les macrophages, les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses et les mégacaryocytes. Au delà de son rôle en tant que récepteur de clairance, LRP1 est également capable d’induire une cascade de signalisation et son implication dans les mêmes processus pathologiques que ceux impliquant le FW a été démontrée. L’hypothèse selon laquelle le FW serait engagé dans ces processus par l’intermédiaire du récepteur LRP1 est donc particulièrement séduisante.
Il est à noter que le FW est incapable de se lier à LRP1 dans des conditions statiques mais doit au préalable être exposé à des contraintes de cisaillement (flux). Ce type d’interaction est réminiscent de l’interaction existant entre le FW et son récepteur plaquettaire la glycoprotéine Ib et s’explique par la structure multimérique complexe du FW. En conditions statiques ou de flux peu rapide, le FW adopte une conformation globulaire repliée dans laquelle certains sites d’interactions sont inaccessibles. L’exposition de la molécule à un flux rapide entraine un changement de conformation du FW vers une forme étirée capable d’interagir aves ses récepteurs.
En conséquence, le but de ce projet est d’explorer plus en détails ces aspects hémodynamiques de l’interaction entre le FW et LRP1. Trois objectifs plus spécifiques sont visés :
1: Identifier le(s) site(s) d’interaction pour LRP1 sur le FW
2: Appréhender la manière dont les mutations du FW identifiées chez des patients, modulent la liaison avec LRP1 en relation avec la pathologie de la MW
3: Déterminer comment l’interaction FW-LRP1 affecte la fonction, la viabilité et la morphologie des cellules exprimant LRP1
Afin de poursuivre ces différents objectifs, une approche transversale sera utilisée, combinant la biochimie, la biologie cellulaire et des modèles animaux dédiés. Le projet aura également un versant clinique puisque nos résultats contribueront à une meilleure compréhension de la MW et probablement aussi d’autres conditions pathologiques. Un point fort de cette application réside dans la disponibilité immédiate de tous les outils nécessaires, in vitro et in vivo. De plus le coordonateur de ce projet possède une expérience de plus de 15 ans sur l’étude du FW et de LRP1.
Ce projet est tout à fait opportun et novateur d’un point de vue scientifique puisqu’il s’appuie sur une interaction assez inhabituelle entre deux protéines multifonctionnelles, interaction qui vient d’être identifiée. Il existe donc de nombreuses voies à explorer en ce qui concerne les conséquences physiopathologiques de cette interaction. Nous estimons également que cette étude pourra servir de base pour le développement de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement de la MW, dans l’hémophilie et dans un certain nombre de pathologies thrombotiques faisant intervenir le FW.

 

Programme ANR : Blanc - SVSE 1 - Physiologie, physiopathologie, santé publique (Blanc SVSE 1) 2013

Référence projet : ANR-13-BSV1-0014

Coordinateur du projet :
Monsieur Peter J Lenting (Inserm Unit 770)

 

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L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.