Approches bisusubstrat et prodrogue pour la conception d’inhibiteurs inédits de la DXR: Nouveaux antimicrobiens et antituberculeux – ANTITUB

Nous nous proposons de développer des inhibiteurs de type bisubstrat, des composés qui ciblent à la fois la site actif de la DXR et le site du cofacteur, une stratégie efficace qui pour certaines protéines permet d’obtenir une importante et spécifique inhibition. Pour réaliser ce projet, nous utiliserons des approches computationnelles, la modélisation moléculaire et des simulations de dynamique moléculaire pour mettre en évidence les interactions de l’enzyme avec le bisubstrat, l’objectif étant d'optimiser la conception et la synthèse de bisubstrats appropriés. Deux approches parallèles seront utilisées. Tout d'abord, nous préparerons des composés possédant à la fois un inhibiteur de substrat et un inhibiteur du NADPH. La deuxième approche basée sur la synthèse in situ de médicaments, a pour objectif d’étudier la formation moléculaire in situ d’inhibiteurs irréversibles à deux substrats. Des biligands bioorthogonaux appropriés et complémentaires seront conçus afin que l’enzyme cible synthétise un inhibiteur irréversible via une réaction click in situ. La seconde problématique liée à la biodisponibilité et à l'imperméabilité des inhibiteurs de DXR vis à vis des bactéries et mycobactéries pourra être surmontée en synthétisant les inhibiteurs sous forme de prodrogues. Les composés seront testés sur l’enzyme purifiée d’ E. coli et de M. smegmatis et les données cinétiques seront déterminées. L’Inhibition de la croissance sera réalisée sur des bactéries non pathogènes, comme E. coli et M. smegmatis ainsi que sur des pathogènes, comme M. tuberculosis. L'activité antibiotique des inhibiteurs synthétisés sera effectuée sur des macrophages infectés par M. tuberculosis à l'aide d'un procédé d'imagerie de fluorescence. En outre, nous étudierons les modifications structurales de la paroi cellulaire des bactéries cultivées en présence des composés synthétisés par RMN solide à l’angle magique.

Des simulations de dynamique moléculaire réalisées sur le complexe DXR-fosmidomycine, ont permis de mettre en évidence des interactions cruciales dans la formation du complexe. En se basant sur ces résultats, plusieurs ligands bioorthogonaux appropriés et complémentaires de type azoture et cycloalcynes, ont été envisagés ainsi que différents bi-substrats. Une série d’azoture fixé sur l’atome d’azote via un bras espaceur, a été synthétisée et inhibe la DXR d E. coli. La synthèse d’alcynes contraints étant fastidieuse, différents alcynes vrais fonctionnalisés par des mimes de NADPH, sélectionnés suite aux travaux de modélisation moléculaire, a été réalisée. Ces composés testés sur la DXR ne montrent pas d’inhibition particulière. Excepté pour les triazoles bi-substrats, préparés par réaction de click, tous les autres bi-substrats sélectionnés par des études d'amarrage moléculaire et synthétisés, ne présentent pas d’activité sur la croissance d’E.coli. Afin de palier à ces résultats, une poche allostérique de la DXR a été ciblée. Guidés par des études de docking, des nouveaux bi-substrats ont été synthétisés, offrant de nouvelles perspectives, puisqu’ils sont aussi efficaces que la fosmydomycine. L’analogue phosphate de la fosmidomycine, la fosfoxacine et ses dérivés synthétisés présentent des inhibitions différentes de la DXR selon les microorganismes. Afin de tenter d’expliquer cette différence, des études de dynamiques moléculaires des complexes ont été effectuées. Nous avons réalisé une quarantaine de prodrogues, dont 14 d’entre elles inhibent efficacement la croissance de M. smegmatis et P. falciparum. Des prodrogues de type phosphoramidate sont inactives sur ces deux souches bactériennes. Pour mettre au point la méthode, des premières expériences RMN HR-MAS ont été réalisées sur le culot de mycobactéries non traitées et traitées à l’éthambutol, un antituberculeux.

D’un point de vu fondamental, il serait intéressant d’étudier le mécanisme de changements de conformations de boucle de confinement du site actif conduisant à son ouverture et fermeture, ainsi que la relation entre la fixation d’un ligand en fonction de la séquences des protéines, dont l’objectif est le développement d’inhibiteurs plus efficaces et spécifiques

Afin de tester la faisabilité de réaction de click in situ avec la DXR il est nécessaire de poursuivre la synthèse d’alcynes contraints fonctionnalisés. Les résultats obtenus en ciblant une poche hydrophobe située dans le site actif de la DXR, ouvrent de nouvelles perspectives pour la conception de nouveaux inhibiteurs de la DXR. Afin d’être testés sur des souches de mycobactéries, les bi-substrats devront être synthétisés sous forme de prodrogues. Pour augmenter l’efficacité des agents thérapeutiques, les stratégies mutual prodrogues et de bisprodrogues des inhibiteurs de la DXR sont des pistes à développer.
Les résultats obtenus ouvrent de nouvelles perspectives dans le contexte de résistance actuel, où il y a un besoin urgent de nouveaux antibiotiques et d’antituberculeux. C’est pourquoi, il seraient intéressant de tester sur les souches de bactéries classées par l’OMS comme pathogènes prioritaires (Shigella dysenteriae, Hélicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia ….. )

1- Synthesis and biological evaluation of phosphate isosters of fosmidomycin and analogs as inhibitors of Escherichia coli and Mycobacterium smegmatis 1-deoxyxylulose 5-phosphate reductoisomerases.
Munier M, Tritsch D, Krebs F, Esque J, Hemmerlin A, Rohmer M, Stote RH, Grosdemange-Billiard C.*
Bioorg Med Chem., 2017, 25, 684-689.

2- Toward the design of novel antimicrobials: Synthesis and biological evaluation of phosphate isoster of fosmidomycin and analogs. PharmaMed-2016, International Conference on Medicinal and Pharmaceutical Chemistry,
Dubai (UAE),5-7 décembre 2016,

3- Original approach for the synthesis of deoxy-xylulose phosphate reductoisomerase (DXR) inhibitors: access to bi-ligands. A. Dreneau, D.Tritsch, M. Rohmer & C. Grosdemange-Billiard
53ième Semaine d’Etude en Chimie Organique,
Sulniac, (France), 24 Mai-9Juin 2016

4- Prodrug approach for the rational design of new deoxyxylulose phosphate reducto-isomerase (DXR) inhibitors: potential antitubercular drugs.
M.Munier, D.Tritsch, M. Rohmer and C. Grosdemange-Billiard, 16th Tetrahedron Symposium - Challenges in Bioorganic & Organic Chemistry, Berlin, (Allemegne), 16-19 Juin 2015

5- Molecular dynamic study of ligand recognition by DXR: implication for the design of new antibiotic.
Fanny Krebs, Catherine Grosdemange-Billiard, Roland Stote.
Groupe thématique Enzymes-Groupe Graphisme et Modélisation Moléculaire (GT enzymes-GCMM),
Sète (France) 25-28 Mai 2015

6- From the discovery of a novel isoprenoid biosynthesis pathway to the design of new antimicrobials.
C. Grosdemange-Billiard
BIT’s 5th Annual International Congress of Medchem,
Suzhou (Chine), 18-20 novembre 2014.

Actuellement, presque toutes les infections microbiennes importantes à travers le monde, telles que la tuberculose, le paludisme, les maladies nosocomiales, sont devenues résistantes aux antibiotiques. La résistance multi-médicamenteuse est problème de santé publique à l’échelle planétaire. Il est donc urgent de trouver de nouvelles cibles pour de nouveaux antimicrobiens. Les protéines impliquées dans la biosynthèse des isoprénoïdes représentent l’une de ces cibles. Les isoprénoïdes sont présents chez tous les organismes vivants et sont notamment essentiels pour toutes les bactéries. La voie alternative, indépendante du mévalonate ou voie du méthylérythritol phosphate MEP est la voie de biosynthèse des isoprénoïdes chez de nombreuses bactéries pathogènes, comme par exemple Mycobacterium tuberculosis, M. leprae, ainsi que chez des agents pathogènes opportunistes, comme par exemple les entérobactéries, Acinetobacter spp., Pseudomonas spp et dans les différentes espèces de Plasmodium, parasite responsable du paludisme. Toutefois la voie du MEP est absente chez l'homme. C’est pourquoi elle représente une cible de choix pour la conception et le développement de nouveaux antimicrobiens. Par conséquence, toutes les enzymes de la voie du MEP représentent des cibles potentielles pour la conception d'un type nouveau et inexploré d’antibactériens et antiparasitaires, avec des effets secondaires minimes attendus pour le patient.

L’objectif de projet est de combiner les connaissances et l'expertise des différents groupes de recherche en bioinformatique, enzymologie, biochimie, biophysique et en synthèse organique pour concevoir et développer de nouveaux antimicrobiens ayant pour cible , la DXR, la deuxième enzyme de la voie du MEP, qui nécessite la présence dans son site actif, d’un cation métallique divalent tel que Mg2 + ainsi qu’un cofacteur, le NADPH. Nous nous proposons de développer des inhibiteurs de type bisubstrat, des composés qui ciblent à la fois la site actif de la DXR et le site du cofacteur, une stratégie efficace qui pour certaines protéines permet d’obtenir une importante et spécifique inhibition. Pour réaliser ce projet, nous utiliserons des approches computationnelles, la modélisation moléculaire et des simulations de dynamique moléculaire pour mettre en évidence les interactions de la l’enzyme avec le bisubstrat, l’objectif étant d'optimiser la conception et la synthèse de bisubstrats appropriés. Deux approches parallèles seront utilisées. Tout d'abord, nous préparerons des composés possédant à la fois un inhibiteur de substrat et un inhibiteur du NADPH. La deuxième approche basée sur la synthèse in situ de médicaments, a pour objectif d’étudier dans la formation moléculaire in situ d’inhibiteurs irréversibles à deux substrats. Des biligands biorthogonaux appropriés et complémentaires seront conçus afin que l’enzyme cible synthétise un inhibiteur irréversible via une réaction click in situ. La seconde problématique liée à la biodisponibilité et à l'imperméabilité des inhibiteurs de DXR vis à vis des bactéries et mycobactéries pourra être surmontée en synthétisant les inhibiteurs sous forme de prodrogues. Les composés seront testés sur l’enzyme purifiée d’ E. coli et de M. smegmatis et les données cinétiques seront déterminées. L’Inhibition de la croissance sera réalisée sur des bactéries non pathogènes, comme E. coli et M. smegmatis ainsi que sur des pathogènes, comme M. tuberculosis. L'activité antibiotique des inhibiteurs synthétisés sera effectuée sur des macrophages infectés par M. tuberculosis à l'aide d'un procédé d'imagerie de fluorescence. En outre, nous étudierons les modifications structurales de la paroi cellulaire des bactéries cultivées en présence des composés synthétisés par RMN solide à l’angle magique.

Les connaissances générées devraient permettre le développement d’antimicrobiens et d’antituberculeux d’un nouveau type.