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Retour Post-Doctorants (RPDOC)
Edition 2012


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Mécanismes moléculaires et fonctions de l’hétérogenéité de la tubuline

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Mécanismes moléculaires et fonctions de l’hétérogenéité de la tubuline

Mécanismes moléculaires des modifications de la tubuline et leur implications biologiques pour une meilleure comprehension de leur role spatio-temporel au sein des organismes
Les microtubules sont des éléments clés du cytosquelette eucaryote impliqués dans de nombreuses fonctions cellulaires essentielles. Dans les dernières décennies, des études approfondies ont permis d'élucider les propriétés biophysiques des microtubules, leurs interactions avec les multiples protéines associées aux microtubules (MAPs) et moteurs moléculaires, ainsi que de nombreuses fonctions cellulaires spécialisées du réseau microtubulaire. Alors que la plupart des fonctions et propriétés de base des microtubules ont été étudiées en détail, les microtubules ont généralement été considérés comme des assemblages macromoléculaires homogènes. Ceci est en fort contraste avec l'existence évidente d’identités microtubulaires dans la cellule, qui permettent à ces derniers d'acquérir des propriétés spécifiques pour la spécialisation fonctionnelle. Le projet proposé porte sur deux aspects de l'identité des microtubules: la distribution d’isoformes et les modifications post-traductionnelles. Ces dernières ont été reconnues comme mécanisme de régulation émergent dans l’acquisition d’identités microtubulaires spécifiques.
Afin de comprendre comment les motifs complexes de modifications déterminent les propriétés fonctionnelles des microtubules dans l’espace et dans le temps, ce projet se focalisera sur deux modifications spécifiques : la polyglutamylation et la polyglycylation. Les enzymes responsables de ces deux modifications ont été identifiés et caractérisés préalablement et un des principaux objectifs de ce projet est d’élucider les mécanismes moléculaires responsables de la spécificité et le contrôle de ces enzymes dans la génération de motifs de modification sur les microtubules.

Charactérisation biochimique et structurale de l’hétérogéneité de la tubuline
Afin d'atteindre cet objectif, nous allons également développer les outils nécessaires pour étudier les isoformes de la tubuline et les modifications post-traductionnelles in vitro. Pour cela nous utiliserons une approche d'ingénierie de protéines ambitieuse, en vue d'obtenir de la tubuline recombinante qui peut être modifiée de manière systématique et contrôlée. Une approche plus classique de biochimie et de biologie structurale sera utilisée afin de charactériser les enzymes responsables des modifications post-traductionelles. Ce travail sera intégré au sein même du laboratoire dans un contexte cellulaire et d’organisme.

Résultats

Les 6 premiers mois du projet on donné lieu a une série de résultats préliminaires qui permettront de lancer la production de protéines recombinantes et leurs charactérisation fonctionelle. En bref, une étude bioinformatique sur les différentes isoformes de la tubuline a été réalisée et utilisée afin de produire une librairie de vecteurs d’expression de la tubuline eukaryote ainsi que de chimères eukaryotes/prokaryotes. Des cellules mammifères avec les gènes de tubuline exogène intégrés de manière stable ont été produites et des tests d’expression sont en cours. De nombreuses constructions codant pour les enzymes de modification ont été réalisées pour différents systemes d’expression (bactérien, cellules d’insectes, cellules de mammifères) et des tests d’expression et de purification sont en cours. Une plateforme de production de protéines a été mis en place.

Perspectives

Les résultats obtenus lors de ce projet serviront à adresser des questions spécifiques dans un contexte cellulaire, afin de comprendre les conséquences biologiques des modifications de la tubuline. La dernière partie du projet sera entièrement intégrée dans le contexte du laboratoire d'accueil qui utilise une approche interdisciplinaire allant de systèmes in vitro à des modèles de souris en passant par les modèles cellulaires afin d'étudier ces modifications. Ce travail pourrait avoir un impact fondamental sur la compréhension des fonctions des microtubules dans les cellules et les organismes.

Productions scientifiques et brevets

Tout résultat obtenu pendant les premiers six mois est préliminaire et pas au stade de publication ou depot de brevet

Partenaires

IC Institut Curie; Dept. "Signalling, Neurobiology and Cancer"

Aide de l'ANR 409 848 euros
Début et durée du projet scientifique novembre 2012 - 36 mois

Résumé de soumission

Les microtubules sont des éléments clés du cytosquelette eucaryote impliqués dans de nombreuses fonctions cellulaires essentielles. Au cours des dernières décennies, des études approfondies ont permis d'élucider les propriétés biophysiques des microtubules, leurs interactions avec les multiples protéines associées aux microtubules (MAPs) et les moteurs moléculaires, ainsi que de nombreuses fonctions cellulaires spécialisées du réseau microtubulaire. Cette spécialisation fonctionnelle semble être corrélée à l’existence de différentes identités microtubulaires dans la cellule, ce qui est en fort contraste avec l’image des microtubules comme des assemblages macromoléculaires homogènes. Le projet proposé vise à étudier deux aspects de l'identité des microtubules: la distribution d’isoformes et les modifications post-traductionnelles, ces dernières ayant été reconnues comme un important mécanisme de régulation pour l’acquisition d’identités microtubulaires spécifiques.

Afin de comprendre comment les motifs de modifications déterminent les propriétés fonctionnelles des microtubules dans l’espace (architecture) et dans le temps (dynamique), ce projet se focalisera sur deux modifications spécifiques : la polyglutamilation et la polyglycilation. Les enzymes responsables de ces deux modifications ont été identifiés et caractérisés préalablement dans le laboratoire de Carsten Janke. L’un des objectifs principaux de ce projet est d’élucider les mécanismes moléculaires responsables de la spécificité et le contrôle de ces enzymes dans la génération de motifs de modification sur les microtubules. Afin d'atteindre cet objectif, nous allons également développer les outils nécessaires pour étudier les isoformes de la tubuline et les modifications post-traductionnelles in vitro. Pour ce faire nous utiliserons une approche ambitieuse d'ingénierie de protéines, visant à obtenir de la tubuline recombinante qui pourra être ensuite modifiée de manière systématique et contrôlée. Les résultats ainsi obtenus serviront ensuite à adresser des questions spécifiques dans un contexte cellulaire, afin de comprendre les conséquences biologiques de ces modifications. La dernière partie du projet sera entièrement intégrée dans le contexte du laboratoire d'accueil, qui utilise une approche interdisciplinaire allant de systèmes in vitro à des modèles de souris en passant par les modèles cellulaires afin d'étudier ces modifications. Ce travail pourrait avoir un impact fondamental sur la compréhension des fonctions des microtubules dans les cellules et les organismes.

 

Programme ANR : Retour Post-Doctorants (RPDOC) 2012

Référence projet : ANR-12-PDOC-0021

Coordinateur du projet :
Madame Annemarie WEHENKEL (Institut Curie; Dept. "Signalling, Neurobiology and Cancer")
annemarie.wehenkel@nullmpi-dortmund.mpg.de

 

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L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.