Etudes structurales du 75 kDa prion Sup35 : Vers la RMN du solide des protéines extra-larges – XLproteinSSNMR

La NMR du solide peut structurellement caractériser les protéines à des niveaux différents. Alors il y a quelques années, seulement des relativement petites protéines se prêtaient à cette technique, aujourd'hui des études sur les plus grandes protéines sont explorées. Pour donner une idée des tailles et des niveaux des protéines qui peuvent être étudiés aujourd'hui, on peut affirmer que les protéines de moins de 100 acides aminés se prêtent à la résolution de la structure par RMN du solide, comme l’est montré récemment pour différents ensembles bêta-amyloïde. Des protéines jusqu'à 300-400 acides aminés peuvent être attribués de manière séquentielle et leurs structures secondaires sont ainsi accessibles. Pour les protéines plus grandes, les empreintes digitales peuvent être enregistrées, qui informent sur le contenu de la structure secondaire, l'ordre et sur les interactions avec d'autres molécules. Nous avons ici étendu de manière significative les différents aspects, notamment avec l'étude du prion Sup35 qui est avec 685 les résidus la plus grande protéine étudiée aujourd'hui par RMN du solide.

Le projet a donné un aperçu au niveau atomique dans l'organisation structurelle de la levure prion Sup35 (voir Figure). Nous avons pu montrer que la protéine conserve son repliement natif de son domaine C-terminal dans les fibrilles, et que les 30 premiers résidus construisent un noyau de fibrille très ordonnée. Surtout, ce noyau est structurellement différent quand on regarde Sup35NM, qui est dépourvue du domaine globulaire C-terminal. Cela parle contre l'utilisation de Sup35NM comme un modèle fidèle pour l'étude de la levure biologie des prions. Nous avons pu montrer pour d'autres grands assemblages moléculaires, comme des protéines motrices et fibrilles de protéines, la façon dont ils sont organisés et interagissent avec leurs partenaires.

Nos résultats ouvrent la voie pour des études d'autres assemblages complexes.

Nous avons publié 27 articles dans diverses revues, allant de general ou spécialisé, manière, en fonction des résultats obtenus.

Peu est connu aujourd'hui de la structure de protéines prion entières. Nous avons récemment établi, utilisant des techniques de RMN des protéines Ure2p et HET-s, que les prions montrent différentes architectures, et que les principes de construction peuvent varier considérablement. Nous proposons ici l'étude de la protéine prion Sup35p, qui pose un grand défi considérant sa taille importante, 685 acides aminés. Ayant démontré le rôle important du domaine globulaire, nous visons ici l'étude dans le contexte de la protéine entière, et l'investigation au niveau moléculaire le rôle du domaine C-terminal dans l'assemblage en fibrilles de la protéine. Nous comparerons donc les structures du fragment Sup35NM et Sup35p par RMN du solide. Sup35NM est souvent utilisé comme modèle pour le prion entier, et il va être intéressant de voir si la structure du fragment est conservée dans les fibrilles de la protéine entière ou si elle s'assemble différemment. Cette question est particulièrement pertinente dans le contexte de nos résultats précédents sur les prions HET-s et Ure2p, qui montrent que les structures des fragments et de la protéine entière diffèrent.
Nous allons adresser cette question par des techniques de RMN du solide, qui est une technique émergente pour l'étude de protéines insolubles. Ces dix dernières années ont vu des progrès considérables qui ont fait de la RMN du solide une technique prometteuse pour la biologie structurale. Même s'il a été montré qu'il est en principe possible d'accéder à la structure à haute résolution de fibrilles de prions par cette technique, il est difficile de déterminer des structures de prion entier. La principale difficulté réside dans la grande taille de ces protéines, une propriété qu'elles partagent souvent avec d'autres protéines insolubles. Cependant, de nombreux outils pour vaincre ces obstacles existent déjà dans les laboratoires des équipes déposant ce projet. Nous proposons de développer la méthodologie RMN permettant l'étude de ces protéines et de l’appliquer à la protéine Sup35. La méthodologie RMN que nous proposons de développer dans cette demande va nous permettre d'établir des modèles structuraux que nous allons confronter à la grande collection de connaissances biochimiques et biophysiques existante afin de comprendre la relation entre la structure et les propriétés biologiques de Sup35p. Par ailleurs, les protocoles et techniques établies devront être applicable à d'autres protéines insolubles de grande taille.