Identification et caractérisation du mode d'interaction de phycotoxines neurotoxiques présentant un risque biologique - Développement de nouveaux systèmes de détection. – AquaNeuroTox

Ce projet a bénéficié du rapprochement des expertises scientifiques et techniques des deux équipes participantes (celles du CNRS et du CEA) de Gif-sur-Yvette. L’originalité de l’approche utilisé repose sur une combinaison unique, au sein du consortium, d’expertises et de techniques alliant les approches d’évaluation fonctionnelle in vitro et in vivo, par l’utilisation de techniques d’électrophysiologie conventionnelles aux niveaux cellulaire et intégré, aux études de liaison toxine-récepteur à l’aide de ligands radioactifs sélectifs, selon le principe du déplacement de la liaison entre une toxine et un récepteur par un ligand, et aux techniques de spectrofluorométrie, d’expression de récepteurs (nicotiniques et muscariniques humains) dans des systèmes hétérologues (cellules modèles HEK-293 et CHO en culture, ovocytes de Xénope) ou encore de micro-transplantation de membranes purifiées de Torpille permettant l’incorporation de récepteurs nicotiniques dans leur environnement natif (avec les protéines associées) dans l’ovocyte de Xénope. Ces techniques ont été appliquées aux divers modèles biologiques que nous maîtrisons, complémentaires les uns des autres.

Les principaux résultats obtenus au cours de ce projet sont les suivants : Confirmation de la présence d’anatoxine-a sur certains isolats obtenus lors de la collecte de biofilms de cyanobactéries d’eau douce. Absence d’évidence pour la présence du gène stxA codant pour la saxitoxine dans le Tarn. Détermination des profils de sélectivité et des mécanismes d’action de certaines imines cycliques interagissant avec les récepteurs nicotiniques et muscariniques. Caractérisation du mécanisme ionique impliqué dans l’augmentation du volume nodal des axones myélinisés lors de l’activation des canaux sodium par la ciguatoxine-1B. Développement d’un test de détection de neurotoxines ciblant les canaux sodium et les récepteurs nicotiniques à l’aide de nouveaux traceurs non-radioactifs et de la spectrofluorométrie. Conception et production d’un nouveau test en bandelettes de détection de neurotoxines, présentes de façon intentionnelle ou accidentelle dans l’environnement, agissant sur les récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine, transportable, sensible et de faible coût.

1. Poursuite de l’identification des cyanobactéries présentes dans les eaux du Tarn sur les prélèvements déjà effectués et sur de nouveaux échantillons qui seront collectés prochainement. En particulier, lorsque la biomasse aura été générée, les différents isolats de cyanobactéries seront mis en monoculture. De l’ADN de chaque échantillon sera extrait et analysé par PCR et séquençage, en employant des amorces spécifiques pour des gènes de synthèse de l’anatoxine-a, de la cylindrospermopsine et de la saxitoxine.
2. Obtention de données structurales de l’interaction de diverses phycotoxines avec les récepteurs nicotiniques permettant de comprendre l’origine de leurs sélectivités d’interaction (collaborations P. Marchot/Y. Bourne, CNRS Marseille).
3. Caractérisation pharmacologique de nouvelles toxines (prorocentrolides, ptériatoxines…) obtenues par collaboration.
4. Développement de nouveaux systèmes de détection RBA ciblant les toxines actives sur les canaux sodiques. Synthèse et marquage (biotynylation, fluorescent) de conotoxines large spectre pour ces canaux ioniques et mise au point du système de détection sur des lignées exprimant différents sous-types de canaux NaV.
5. Optimisation du système RBA-microplaque pour les toxines nicotiniques (à l’aide de nouvelle toxine fluorescente) et adaptation au terrain par le développement d’un système bandelette.

Depuis le début du projet, les résultats obtenus ont fait l’objet de 7 articles publiés dans des revues à comité de lecture internationale, 1 article en cours de soumission et 2 articles de vulgarisation dans le cadre du bioterrorisme. De plus, 5 chapitres d’ouvrages collectifs (sur invitation) ont été publiés. Une demande de brevet PCT/EP2015/081060 auprès de l’Office Européen des Brevets a été déposée le 22/12/2015 par le CNRS à La Haye. Titre de l’invention: “Device for detecting neurotoxines and process for manufacture thereof”.

1. Une Déclaration d’invention (DI07822-01) a été déposée le 18.03/2015 au CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE-CNRS : « NEUROTORP – Rapid Lateral Flow Tests Strips » Inventeurs : ARAOZ R., MOLGO J., SERVENT D., MOURIER G. et KESSLER P.

2. STIVALA C.E., BENOIT E., ARÁOZ R., SERVENT D., NOVIKOV A., MOLGÓ J., ZAKARIAN A. (2015). Synthesis and biology of cyclic imine toxins, an emerging class of potent, globally distributed marine toxins. Nat. Prod. Rep., 32: 411-435

3. BOURNE Y., SULZENBACHER G., RADIC Z., ARÁOZ R., REYNAUD M., BENOIT E., ZAKARIAN A., SERVENT D., MOLGÓ J., TAYLOR P., MARCHOT P. (2015). Marine macrocyclic imines, pinnatoxins A and G: structural determinants and functional properties to distinguish …. Structure, 23: 1106-1115

4. ARAOZ R., OUANOUNOU G., IORGA B.I., GOUDET A., ALILI A., AMAR M., BENOIT E., MOLGÓ J., SERVENT D. (2015). The neurotoxic effect of 13,19-didesmethyl and 13-desmethyl spirolide C phycotoxins is mainly mediated by …. TOXICOL. SCI., 147: 156-167

5. MATTEI C., MOLGÓ J., BENOIT E. (2014). Involvement of both sodium influx and potassium efflux in ciguatoxin-induced nodal swelling of frog myelinated axons. Neuropharmacology, 85: 417-426

6. RUBIO F., KAMP L., CARPINO J., FALTIN E., LOFTIN K., MOLGÓ J., ARÁOZ R. (2014). Colorimetric microtiter plate receptor-binding assay for the detection of freshwater and marine neurotoxins targeting the nicotinic acetylcholine receptors. Toxicon, 91: 45-56

Le phytoplancton marin (dinoflagellés/diatomes) et les cyanobactéries d'eau douce produisent des neurotoxines puissantes qui ciblent les composants de la neurotransmission essentiels à la vie ou pour échapper à la prédation, comme par exemple les canaux sodium sensibles au potentiel de membrane et les synapses cholinergiques [récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (nAChR) / acétylcholinestérase]. Dans des environnements marins, les efflorescences algales dangereuses (HABs pour « Harmful Algal Blooms ») totalisent jusqu’à des centaines de millions de dollars de pertes annuelles pour des industries d'aquaculture et représentent une menace à la santé publique. Ainsi, les coquillages peuvent accumuler des molécules bioactives en se nourrissant de phytoplancton toxique. L'empoisonnant humain résulte typiquement de la consommation de coquillages contaminés provoquant des syndromes multiples comme l’intoxication paralysante par les fruits de mer (saxitoxine), l’intoxication amnésique par les fruits de mer (acide domoïque), l’intoxication neurologique par les fruits de mer (brévétoxines), l’intoxication diarrhéiques par les fruits de mer (acide okadaïque et dinophysistoxines) et les intoxications à l’azaspiracide. Dans les eaux continentales, l'exposition aiguë aux efflorescences de cyanobactéries nuisibles, contenant des cyanobatéries produisant de l’anatoxine-a-ou de la saxitoxine, a été montrée être fatale pour les animaux sauvages, de réserves et domestiques ainsi que pour l’Homme. Nous avons récemment déterminé le mécanisme d'action de la gymnodimine-A, du spirolide-C 13-desméthyl, et de la pinnatoxine-A caractérisant ces imines cycliques comme étant la première famille de phycotoxines hautement puissantes pour cibler les nAChRs. Nous avons donc développé une méthode sensible de test de fixation à des récepteurs sur microplaque (microplaque-RBA pour « Receptor Binding Assay”) utilisant des membranes de Torpille riches en nAChRs pour la détection de gymnodimines, de spirolides et d’anatoxine-a dans des fruits de mer et des échantillons d'eau contaminés. En outre, ces organismes toxiques peuvent être isolés à partir d’environnements naturels et facilement cultivés, ce qui constitue un danger potentiel dans le cadre du bioterrorisme quand les provisions d'aquaculture/d'eau douce sont visées. L'objectif de ce Programme de Recherche est : i) de collecter et d’identifier de nouveaux agents toxiques à partir de cyanobactéries, ii) de déterminer la pharmacologie de spirolides non encore étudiés (20 methyl spirolide G) , des analogues des pinnatoxines, et des prorocentrolides qui possèdent tous un groupe imine cyclique et celle de toutes autres toxines nouvellement identifiées, iii) de développer de nouveaux systèmes de récepteurs de toxines pour la détection de toxines ciblant les canaux sodium sensibles au potentiel de membrane et d’autres cibles, iv) d’adapter la méthode de microplaque-RBA à des applications sur le terrain en développant des microsystèmes basés sur la capacité des membranes de Torpille à couvrir des surfaces en plastique et des nanofluides pour des interactions entre les récepteurs et les toxines.