L’Orange Carotenoid Protein : une protéine photoactive impliquée dans la photoprotection chez les cyanobactéries – CYANOPROTECT

Le succès du projet CYANOPROTECT nécessite une collaboration étroite entre des laboratoires possédant des expertises en biochimie (isolement des protéines et des complexes), génétique (construction des mutants et régulation des gènes) et physiologie (mesures de photoprotection et activités photosynthétiques) des cyanobactéries, et en méthodes spectroscopiques avancées (Raman et InfraRed (FTIR))permettant l'étude des changements de conformation de l'OCP. Ces compétences complémentaires sont assurées par les deux partenaires participant à ce projet, qui ont déjà collaboré à plusieurs reprises sur des projets internationaux. Le fait qu'ils soient épaulés par des collaborations internationales avec des laboratoires experts en spectroscopie d'absorption et de fluorescence par flash ultrarapide et mesures sur molécules uniques (van Grondelle, Amsterdam et van Amerongen, Wageningen), et des cristallographes spécialisés dans l'étude de l'OCP et des phycobilisomes (Kerfeld, Berkeley et Adir, Haifa) donne à ce projet toutes les chances de réussite.
Le groupe de Mme Kirilovsky construira et caractérisera tous les mutants de cyanobactéries nécessaires pour cette étude et isolera les protéines OCP et FRP et les complexes phycobilisomes et OCP-phycobilisomes. Le groupe de M Robert étudiera l’influence de la protéine sur le carotenoïde en utilisant la spectroscopie Raman et le photocycle de l’OCP en utilisant les spectroscopies Raman et FTIR ; le groupe de M van Grondelle étudiera les états excités du carotenoïde et le mécanisme de « quenching » avec des mesures de spectroscopie d'absorption par flash ultrarapide et celui de M van Amerongen élucidera le site du quenching par mesures de cinétiques de fluorescence ultrarapide. Finalement, en collaboration avec les laboratoires de Mme Kerfeld et M Adir les structures de la FRP, de la forme active rouge de l’OCP et de complexes phycobilisomes-OCP vont être résolues.

Des grandes avancés dans l’élucidation des mécanismes d’action de l’OCP et la FRP dans la photoprotection ont été effectués :
1) Nous avons réussi à reconstruire in vitro le système de photoprotection en utilisant des phycobilisomes, de l’OCP et la FRP. En utilisant ce système nous avons démontré que 1) uniquement la forme rouge de l’OCP est capable de s’attacher aux phycobilisomes et d’induire le quenching, 2) cet attachement est indépendant de la lumière, par contre l’activation de l’OCP dépend de l’intensité lumineuse, 3) la protéine FRP déstabilise l’interaction entre l’OCP et le phycobilisome et accélère sa désactivation. Nous sommes capables maintenant d’isoler des complexes OCP-phycobilisomes essentiels pour l’étude du mécanisme de « quenching ».
2) En utilisant des mutants de phycobilisomes et des complexes OCP-PBs avec des mesures de cinétiques de fluorescence ultrarapide nous avons démontré que le site du quenching dans le phycobilisome est un trimer d’allophycocyanine émettant de la fluorescence à 660 nm.
3) Nous avons identifié un acide aminé, l’arg 155, essentiel pour l’attachement de l’OCP aux phycobilisomes. De plus nos résultats montrent que la structure de la forme active rouge de l’OCP est plus ouverte que celle de la forme inactive orange.
4) Nous avons décrit les caractéristiques des états excités du carotenoïde dans la forme active (rouge) et inactive (orange) de l’OCP
5) Nous avons résolue la structure tridimensionnelle de la FRP et identifié les acides aminés essentiels pour son activité .
6) Nous avons isolé les domains N-terminal and C-terminal de l’OCP et nous avons demontré que la partie N-terminal retient le carotenoide et est capable de s’unir aux PBs et « quencher » leur fluorescence.
7) La comparaison de deux OCPs et leur action sur différents types of PBs, nous a permis d’élucider les site d’attachement du OCP et de montrer que la structure des PBs et OCPs jouent un rôle important dans l’affinité des OCPs pour les PBs.

Perspectives

Les prochains mois notre recherche va être centrée sur les points suivants :
1) Le photocycle de l’OCP : études à différentes températures de la photoactivation et désactivation de l’OCP en utilisant la spectroscopie FTIR, Raman et ultra-rapide transient absorption (collaboration avec lab de M van Grondelle)
2) Influence des mutations de l’OCP sur les caractéristiques spectroscopiques du carotenoïde en utilisant de la spectroscopie Raman
3) Mécanisme de la dissipation thermale de l’énergie en collaboration avec le laboratoire de M van Grondelle.
Etant donné que nos recherches ont avancé plus rapidement que prévu de nouvelles thématiques vont être abordées :
1) Etude sur le rôle des protéines codées par des gènes homologues à celui codant pour la partie N-terminale de l’OCP.
2) Etude de la régulation transcriptionnelle des gènes ocp et frp. Etude des promoteurs.

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Lijin Tian, Ivo H.M. van Stokkum, Rob B. M. Koehorst, Aniek Jongerius, Diana L. Kirilovsky, and Herbert van Amerongen (2011) J. Am. Chem. Soc., 133 (45) 18304-18311
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Denis Jallet, Michal Gwizdala and Diana Kirilovsky (2012) Biochim Biophys Acta 1817, 1411-1427
Rudi Berera, Ivo HM van Stokkum, Michal Gwizdala, Adjélé Wilson, Diana Kirilovsky and Rienk van Grondelle (2012) J Physical Chemistry B, 116: 2568-2574
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Wilson A, Gwizdala M, Mezzetti A, Alexandre M, Kerfeld CA, Kirilovsky D (2012) Plant Cell, Plant Cell, 24 1972-1983
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Berera,R, Gwizdala,M, van Stokkum,I, Kirilovsky, D, van Grondelle, Rienk (2013) J Physical Chemistry B 117, 9121-9128
Leverenz, R, Jallet D, Li M-D, Mathies RA, Kirilovsky D, Kerfeld C (2013) Plant Cell (in press)
Jallet D, Thurotte A, Leverenz R, Prreau F, Kerfeld C, Kirilovsky D (2013) Plant Physiol (in press)

Les organismes photosynthétiques renouvellent l'oxygène atmosphérique de la terre, produisent l'essentiel de la biomasse, et représentent une potentielle source d'énergie propre et renouvelable. Leur efficacité à convertir l'énergie solaire dépend d'un équilibre subtil entre leur capacité à collecter les photons solaires, d'une part, et à se protéger contre le stress photo-oxydatif de l'autre. Comme les plantes et les algues, les cyanobactéries –qui sont les organismes les plus abondants sur notre planète- se protègent contre les dommages photo-oxydatifs, en convertissant une part de l'énergie solaire absorbée en chaleur, régulant de fait l'énergie transférée de leurs antennes vers les photosystèmes. Ce type de processus a été largement étudié chez les plantes supérieures. Il n'a cependant été découvert que récemment chez les cyanobactéries, et procède de mécanismes clairement différents mais encore pauvrement caractérisés.
Nous avons récemment montré que chez les cyanobactéries, la dissipation de l'énergie d'excitation en chaleur est induite par l'activation par la lumière d'une protéine soluble, contenant un caroténoïde, l'OCP (orange-carotenoid protein). L'illumination par une lumière bleu-verte intense induit un changement de conformation de cette protéine, et sa conversion en une forme rouge active relativement instable. L'OCP est la première protéine photoactive contenant un caroténoïde comme chromophore. Par ailleurs, le photocycle de l'OCP semble complètement différent des autres protéines photoactives. Presque rien n'est connu du mécanisme de photoactivation de cette protéine, ni de la manière dont elle assure la photoprotection. Nous avons de plus récemment montré qu'une autre protéine, la FRP (fluorescence recovery protein) intervient dans ce processus. Elle est essentielle pour récupérer la capacité maximale de l’antenne sous faibles intensités lumineuses. Le premier but de CYANOPROTECT est d'élucider les mécanismes moléculaires régissant l'activité de l'OCP et de la FRP.
Dans le cadre de ce projet, l'OCP sera aussi utilisée par ailleurs comme une protéine modèle pour étudier comment les protéines influencent les propriétés électroniques des caroténoïdes, et donc comprendre comment ces molécules assurent leurs fonctions de photoprotection dans la vision et plus généralement d'anti-oxydants. L'OCP est un modèle idéal pour mener à bien un tel projet, car c'est une protéine soluble qui ne lie qu'un seul caroténoïde, et qui peut être aisément génétiquement modifiée dans Synechocystis 6803, l'organisme concerné par ce projet.
Ce projet présente aussi un intérêt d'application majeur. En effet, la connaissance et les souches qui vont résulter de notre travail pourraient permettre une meilleure optimisation de la production de biomasse par les cyanobactéries.
Le succès du projet CYANOPROTECT nécessite une collaboration étroite entre des laboratoires possédant des expertises en biochimie, génétique et physiologie des cyanobactéries, et en méthodes spectroscopiques avancées permettant l'étude des changements de conformation de l'OCP. Ces compétences complémentaires sont assurées par les deux partenaires participant à ce projet, qui ont déjà collaboré à plusieurs projets internationaux et appartiennent au même campus de recherche. Ces deux partenaires sont des groupes reconnus internationalement comme des experts dans leurs domaines, publiant dans des journaux à fort coefficients d'impact (Nature, PNAS, Plant Cell). Le fait qu'ils soient épaulés par des collaborations internationales avec des laboratoires experts en spectroscopie d'absorption par flash ultrarapide et mesures sur molécules uniques (van Grondelle, Amsterdam et van Amerongen, Wageningen), et des cristallographes spécialisés dans l'étude de l'OCP et des antennes des cyanobactéries (Kerfeld, Berkeley and Adir, Haifa) donne à ce projet toutes les chances de réussite.