Interactions des co-activateur de transcription TFIID, ATAC et SAGA avec la chromatine – ChromAct

Nous cherchons à décrire la forme et les mouvements des édifices moléculaires contrôlant l’expression des gènes. Nous utilisons un microscope électronique pour visualiser ces édifices et des méthodes d’analyse d’image pour déterminer la forme de ces molécules en trois dimensions. Pour éviter la déshydratation des molécules, elles sont congelées avant d’être introduites dans le vide du microscope.

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Ce projet vise à étudier les mécanismes fondamentaux qui gouvernent l'expression des gènes eucaryotes au stade de l’initiation de la transcription. Les efforts combinés de biologistes moléculaires, structuraux et de chimistes seront mis à profit pour explorer cette thématique. La transcription est régulée par des co-activateurs; de grands complexes macromoléculaires dont l'action résulte en l’assemblage d’un complexe de pré-initiation sur le promoteur des gènes. Pour activer l'expression de ces gènes, de petites protéines activatrices se lient à des séquences d’ADN spécifiques placées en amont des promoteurs géniques où elles recrutent les coactivateurs. Les sites de liaison peuvent être placés à quelques centaines de paires de base en amont du site d’initiation de la transcription ou alors dans des séquences « enhancer » situées à une distance de plusieurs milliers de paires de base. Ces effets à longue distance sont actuellement mal compris. Le rôle des coactivateurs ne se limite pas à faire le lien entre les activateurs transcriptionels et le complexe de préinitiation, mais ceux-ci modifient aussi l'organisation chromatinienne des promoteurs pour faciliter l'accès à la machinerie transcriptionelle. Peu de choses sont connues sur l'organisation structurale de tels assemblages chromatiniens et sur le réseau d'interactions entre activateurs, coactivators, chromatine et facteurs généraux de transcription. De surcroît, il apparait que les co-activateurs collaborent pour activer un gène suggérant qu'ils jouent des rôles complémentaires. Le rôle cellulaire exact des co-activateurs est mal compris ; ils pourraient ainsi organiser la chromatine à longue distance comme dans l’interaction entre le promoteur et les séquences « enhancer » ou dans les processus de formation de boucles de chromatine entre les extrémités 5’ et 3’ d’un gène.
Pour tenter de répondre à ces questions, nous étudierons les coactivateurs TFIID, SAGA et ATAC ; chacun ayant des caractéristiques particulières de reconnaissance du promoteur et des séquences « enhancer ». Nous utiliserons une approche multi-résolution pour analyser l'architecture moléculaire des complexes d'initiation de transcription activés qui se forment in vitro ou in vivo sur des matrices d'ADN contenant des nucléosomes. Nous mettrons en œuvre des méthodes de purification macromoléculaires, différentes modalités de microscopie électronique à haute résolution, des méthodes d’immunoprécipitation de chromatine à haut débit ainsi que nouvelles méthodes de conjugaison d'anticorps et de transduction des anticorps modifiés dans des cellules vivantes afin d’aborder ces questions biologiques par une approche de biologie structurale intégrée.
La cryo-microscopie électronique, associée à des protocoles d'analyse d'image de particules isolées, sera utilisée pour déterminer des modèles structuraux des coactivateurs purifiés. Ces modèles seront utilisés comme références pour identifier et positionner les coactivateurs dans des assemblages de grande taille formés in vitro à partir de réactifs purifiés ou formés in vivo. La combinaison des méthodes de visualisation des produits d’immunoprécipation de chromatine et d’analyse d'image de microscopie électronique jettera un éclairage nouveau sur l'environnement chromatinien local des promoteurs de gène ainsi que sur les interactions à longue distance promus par les coactivateurs. Enfin nous visons à délivrer des anticorps couplés à des particules denses aux électrons dans des cellules vivantes pour marquer et identifier les coactivateurs dans leur environnement cellulaire. L'utilisation combinée de la tomographie électronique et du marquage avant inclusion constitue une percée significative pour beaucoup d'applications biologiques puisqu'elle permettra la détection de protéines nucléaires dans leur environnement cellulaire 3-D à une résolution de 3-4 nm.