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Blanc - SVSE 5 - Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5)
Edition 2011


photo-SRM


Fragmentation optique

Photo-dissociation laser pour la quantification par spectrométrie de masse de biomarqueurs
La spectrométrie de masse est un outil de choix pour la quantification des protéines biomarqueurs dans le sang et l’urine. La photo-SRM implique une dissociation par un faisceau laser émettant dans le visible de peptides étiquetés par un chromophore afin d’améliorer la spécificité et le seuil de détection.

Dosage de biomarqueurs protéiques par spectrométrie de masse et dissociation laser
Les projets d’analyse protéomique appliqués aux grandes pathologies humaines ont permis de découvrir des dizaines de candidats biomarqueurs. La difficulté réside désormais dans l’évaluation clinique de ses candidats afin de discerner ceux qui possèdent un véritable pouvoir de discrimination entre patients sains et malades. La spectrométrie de masse s’impose aujourd’hui comme une alternative crédible aux dosages par les techniques immuno-enzymatiques. Cependant, la complexité des mélanges peptidiques requiert un échantillonnage pré-analytique complexe afin de détecter et de quantifier les biomarqueurs ciblés présents à de très faibles concentrations du fait de composés majoritaires interférents. Afin d’accroître la spécificité de détection de la spectrométrie de masse, le projet Photo-SRM propose de substituer à l’étape classique de fragmentation des peptides par collision une dissociation par un faisceau laser. Ainsi, en étiquetant une sous population bien définie de peptides (peptides à cystéine) par une sonde optique absorbant à la longueur du laser, seuls les peptides dérivés devraient être détectés au sein de mélanges complexes. Différents chromophores commerciaux ou conçus par synthèse chimique seront testés du point de vue de leur capacité à se fragmenter sous irradiation laser et donc à améliorer le rapport signal sur bruit. L’objectif poursuivi est le développement de méthodes validées de dosages multiplexés de protéines dans le sang ou les urines.

Développement de la méthode de quantification Photo-SRM
La preuve de concept de la méthode Photo-SRM est conduite en étiquetant à l’aide d’un chromophore commercial (chromophores de synthèse non disponibles) des peptides à cystéine de protéines du plasma humain. Les rapports signal sur bruit de la détection de ces protéines par approche SRM classique et par Photo-SRM sont comparés. Un spectromètre de masse commercial a été modifié pour implémenter un faisceau laser.

Résultats

Un spectromètre de masse commercial a été acquis au démarrage du projet et a été modifié pour permettre l’implémentation d’un faisceau laser dans l’axe du trajet des ions. Cette modification réalisée n’a pas entrainée de détérioration des performances initiales de l’instrument. La synthèse de chromophores « maison » a été initiée ciblant le couplage des fonctions thiols des cystéines. Une évaluation des chromophores commerciaux a permis d’identifier une molécule intéressante – le DABCYL activé sous forme maleimide – qui engendre après couplage sur les peptides à cystéine un haut rendement de photo-dissociation. En ciblant un panel de protéines plasmatiques couvrant une large gamme de concentration, la Photo-SRM démontre des performances équivalentes sinon supérieures à l’approche SRM conventionnelle dans sa capacité à détecter les peptides à cystéine de ces protéines. La Photo-SRM s’intègre donc comme une alternative crédible au dosage des protéines dans le domaine de la clinique.
Les résultats préliminaires sont susceptibles de déboucher sur un partenariat avec la société AB Sciex (Toronto, Canada), constructeur de spectromètre de masse
La Photo-SRM pourrait être exploitée dans le cadre de la création de la start-up Screenics.

Perspectives

A l’horizon d’une dizaine d’années, différents acteurs anticipent l’implantation de la spectrométrie de masse comme un outil de dosage en routine de biomarqueurs protéiques dans le domaine du diagnostic clinique ou du dépistage. Dans ce contexte, la spectrométrie de masse combinée à la photo-SRM peut constituer une alternative majeure à la méthode classique qui repose sur une fragmentation par collision. Les travaux préliminaires démontrent en effet qu’en ciblant les peptides rares à cystéine, le gain de spécificité est très significatif pour certaines protéines. La photo-SRM en abaissant les seuils de détection ou bien en permettant de simplifier les protocoles d’échantillonnage amont pourrait ainsi constituer un outil incontournable pour le dosage multiplexé des protéines en santé humaine.

Productions scientifiques et brevets

A l’issue des 6 mois après le démarrage du projet photo-SRM, un article a été soumis en Août 2012 au journal Analytical Chemistry
TITRE : IMPROVED DETECTION SPECIFICITY OF PLASMA PROTEINS BY TARGETING CYSTEINE-CONTAINING PEPTIDES WITH PHOTO-SRM

Partenaires

ENS ECOLE NORMALE SUPERIEURE DE LYON

LASIM UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON I

LSA UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON I

Aide de l'ANR 542 713 euros
Début et durée du projet scientifique - 36 mois

Résumé de soumission

De très nombreuses phases de découverte par approches protéomiques ont été initiées depuis une dizaine d'année dans la perspective d'identifier des candidats biomarqueurs précoces associés aux cancers ainsi qu'à de nombreuses autres pathologies. Une technologie est désormais essentielle pour assurer à moindre coût et plus rapidement l'étape intermédiaire que constitue l'évaluation clinique de ces candidats biomarqueurs et ce avant le développement et la validation des tests immuno-enzymatiques nécessaires aux études sur les grandes cohortes. La spectrométrie de masse quantitative est récemment apparue comme un outil opportun. Cette quantification repose sur l’intégration d’un chromatogramme traçant le signal obtenu en détectant un ion fragment issu de la fragmentation de l’ion précurseur de la molécule ciblée (ou transition). Cette sélection ion précurseur/ion fragment est appelée transition et est détectée en mode Selected Reaction Monitoring (SRM) par le spectromètre de masse. Cependant, de nombreux progrès demeurent nécessaires pour que cette technologie approche dans le cas des protéines les seuils de détection les plus bas des techniques de dosage immuno-enzymatique. Après hydrolyse par la trypsine d’un échantillon plasmatique, le signal des peptides rapporteurs de la présence de biomarqueurs faiblement concentrés est en effet fortement atténué par la présence des peptides issus des protéines majoritaires. Afin de diminuer considérablement cet effet matrice, la technologie de photo-SRM que nous souhaitons développer substitue à l’activation collisionnelle classique, non discriminante, une fragmentation spécifique catalysée par une excitation lumineuse. Seuls les peptides contenant un résidu de cystéine et étiquetés par une sonde photo-clivable absorbant à la longuer d’onde à 532nm du laser seront ainsi dissociés. La conception et la synthèse de cette sonde, ainsi que la modification d’un spectromètre de masse commercial, sont deux des trois objectifs majeurs de ce projet. Le troisième objectif vise le développement et la validation d’une méthode de dosage par photo-SRM de l’antigène spécifique de la prostate dans une cohorte d ‘échantillons cliniques.

 

Programme ANR : Blanc - SVSE 5 - Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (Blanc SVSE 5) 2011

Référence projet : ANR-11-BSV5-0003

Coordinateur du projet :
Monsieur Jérome Lemoine (UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON I)
jerome.lemoine@nulluniv-lyon1.fr

 

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L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.