Analyse génétique des échafaudages synaptiques extracellulaires chez C. elegans. – SYNAFOLD

Aux synapses chimiques, la distance entre les sites de libération des neurotransmetteurs et leurs récepteurs est un des paramètres essentiels qui conditionnent l'efficacité de la transmission synaptique. Au cours de travaux antérieurs, nous avons montré que l’accumulation synaptique des récepteurs de l’acétylcholine (RAChs) à la jonction neuromusculaire de l’organisme modèle Caenorhabditis elegans dépend d’un échafaudage extracellulaire situé dans la fente synaptique (Gally et al., Nature 2005; Gendrel et al., Nature 2009; Rapti et al., EMBO J., 2011). Cependant, le mécanisme d’ancrage de cet échafaudage dans la fente synaptique reste inconnu. Nous proposons d’utiliser le complexe extracellulaire lié au RACh comme point d'entrée pour identifier et analyser les mécanismes par lesquels la matrice extracellulaire pourrait contribuer à la congruence des microdomaines pré- et postsynaptiques. Plus spécifiquement, nous allons :

1/ Réaliser un crible visuel direct pour isoler des mutants présentant une distribution anormale des AChRs.
Ce crible sera effectué après mutagenèse aléatoire et indépendamment de tout phénotype comportemental, en utilisant une souche « knock-in » permettant de visualiser les RAChs dans l’animal vivant. Les gènes mutés seront identifiés grâce aux nouvelles stratégies de reséquençage du génome entier. Ce crible permettra d’identifier non seulement de nouveaux gènes nécessaires à la localisation synaptique des RAChs, mais aussi des gènes impliqués dans la l'édification des synapses cholinergiques.

2/ Caractériser une nouvelle protéine ressemblant aux désintégrine/métalloprotéinases (ADAMTSL) qui contrôle la localisation des RAChs.
Les ADAMTSL sont des protéines secrétées probablement associées à la matrice extracellulaire mais dont la fonction est mal connue. Lors d’une expérimentation pilote visant à valider notre stratégie de criblage, nous avons identifié une mutation dans un gène orthologue au gène humain ADAMTSL3. Dans ce mutant, les RAChs sont délocalisés dans des régions extrasynaptiques de la membrane. Le rôle des ADAMTSL à la synapse est un domaine totalement inexploré à notre connaissance.

3/ Valider et caractériser des partenaires du complexe associé aux RAChs identifiés par une approche protéomique.
Nous avons précédemment purifié biochimiquement les complexes protéiques contenant les RAChs. La liste des protéines identifiées par spectrométrie de masse contient en particulier des composants de la matrice extracellulaire, dont le nidogène et des collagènes. Nous allons valider ces interactions et caractériser ces protéines, en analysant en particulier le rôle de la membrane basale dans l’organisation de la synapse.

4/ Combiner la congélation sous haute pression et la microscopie optique super-résolutive pour imager les composants synaptiques en 3D.
Pour analyser l’organisation des microdomaines synaptiques, nous devons pouvoir localiser les composants avec une très bonne résolution tridimensionnelle. Les groupes de S Marty et JL Bessereau vont joindre leurs efforts pour développer une nouvelle méthodologie combinant congélation sous haute pression, microscopie optique super-résolutive STORM sur coupes ultrafines sériées, et reconstructions 3D.

Plusieurs protéines similaires à celles associées aux RAChs de C. elegans sont impliquées dans des pathologies neuro-psychiatriques telles que l’épilepsie, le retard mental et la schizophrénie, mais leurs fonctions moléculaires et cellulaires restent mal connues. Par ailleurs, la mutation d’une des ADAMTSL humaines est responsable de dysplasie géléophysique, une pathologie autosomale récessive grave. Notre projet devrait permettre de proposer des hypothèses testables concernant les fonctions cellulaires et moléculaires de ces différents molécules aux synapses normales et pathologiques.