Bases moléculaires du transport vectoriel de stérol – SterTrans

Nous avons mis en place des essais inédits pour mesurer avec une précision sans précédent le transport de stérol et de PI(4)P en temps réel entre des membranes modèles ainsi que les différentes étapes constituant un tel processus. Pour cela, nous avons pris avantage des caractéristiques de fluorescence du déhydroergostérol, un analogue naturel du cholestérol. Afin d'établir que la protéine OSBP a la capacité d'attacher deux membranes ; nous avons utilisé différentes approches biophysiques. Ce travail a bénéficié de notre expertise en purification des protéines recombinantes et de notre capacité à imiter d'une manière très précise la composition lipidiques des membranes cellulaires. L'analyse structurale par cristallographie aux rayons X de Osh4p a été cruciale pour notre projet. D’autres résultats, issues des approches in vitro, ont été adossés à des obeservation cellulaire par microscopie à fluorescence et microscopie électronique. Cette combinaison d'approches, nous permet de proposer et de valider des schémas mécanistiques nouveaux et constitue une des raisons qui expliquent le succès du projet SterTrans.

Nous révélons que plusieurs ORP/Osh peut garantir un échange inattendu entre stérol et PI (4)P. Cette découverte constitue une avancée importante car elle fournit de nouveaux modèles sur le transport des lipides. Le PI(4)P est un lipide singulier, synthétisé en permanence sur des organelles particuliers et consumé sur le reticulum endoplasmique, où la synthèse de divers lipides a lieu, comme le stérol. Les protéines ORP/Osh pourraient exploiter cette différence de PI(4)P pour transférer du stérol undirectionnellement du réticulum endoplasmique vers d'autres compartiments par échange de lipides, favorisant ainsi l'accumulation de stérol dans ces compartiments. OSBP, d’une complexité structurale supérieure, permettrait d’assurer une tâche similaire dans des régions sub-cellulaires spécifiques dans lesquelles le réticulum endoplasmique est en apposition étroite avec le trans-Golgi. Nos modèles expliquent bien comment des protéines peuvent assurer une distribution précise de stérol à l'intérieur des cellules, notamment le maintien du gradient de stérol entre le réticulum endoplasmique et la surface cellulaire.

Découvrir l'existence d’échangeur stérol/PI(4)P a radicalement changé notre vision sur le transport du stérol. Sur la base de la littérature récente, notre nouvelle hypothèse est maintenant que certaines protéines ORP/Osh utilisent les différences de PI(4)P entre organelles, non pas pour transporter du stérol mais d’autres types de lipides. Ainsi, nous souhaitons examiner à l'avenir dans quelle mesure les mécanismes d'échange lié au PI(4)P constitueraient une stratégie cellulaire générale de transport de lipides. Par ailleurs, il est intéressant de noter que différentes classes de virus, une fois à l'intérieur des cellules, déclenchent une forte perturbation de la composition lipidique de l’appareil de Golgi, notamment une surproduction de PI(4)P, afin de créer des plateformes pour la réplication de leur matériel génétique. De même, certaines voies de cancérisation sont peut-être liées à des perturbations du métabolisme du PI(4)P. OSBP semble impliqué dans ces processus et constitue une cible pour les composés antiviraux et anticancéreux. Nous développons actuellement des projets internes, ou en collaboration, afin de comprendre comment. Nous avons donc ainsi la possibilité de passer à des projets plus appliqués et translationnels.

Fin 2011, nous avons publié un premier article sur l’observation que la protéine Osh4p échange du stérol pour du PI(4)P entre les membranes dans Journal of Cell Biology de portée internationale. Notre travail a été immédiatement reconnu par un article d’accompagnement et pas près de soixante articles au cours de la période 2012-2014. Notre travail le plus récent sur OSBP, publiée dans la revue Cell met en lumière plus de vingt ans d’investigation en biologie cellulaires en fournissant pour la première fois un mécanisme pertinent pour cette protéine. Un troisième manuscrit sur la capacité d’Osh4p à créer des gradients de stérol est actuellement en révision. Nous avons présenté des posters et donné des conférences dans une dizaine de congrés internationaux sur le travail issu du projet SterTrans et avons été invités à rédiger des articles de revue sur le stérol et le transport des lipides (Annual Review in Biochemistry, CMLS, Bioc. Soc. Trans). Notre laboratoire a donc acquis une grande visibilité dans le domaine du métabolisme et du transport des lipides.

Notre projet concerne une large famille de transporteurs et senseurs de stérol pour laquelle il manque des explications en terme mécanistique. Nous savons qu’une distribution correcte de stérol dans les cellules est essentielle à sa viabilité. Une donnée clé est que le stérol est rare dans le réticulum endoplasmique (RE) mais beaucoup plus concentré dans le trans-Golgi et la membrane plasmique. Les protéines ORP/OSH sont devenues récemment les candidats les plus crédibles pour assurer un transport non-vésiculaire de stérol. Par des approches in vitro, nous voulons en comprendre les mécanismes d’action et répondre à une question clef en biologie cellulaire : comment assurer un routage vectoriel de lipides d’une organelle à l’autre avec une protéine.
Nous étudierons Kes1p/Osh4p, protéine ORP/OSH de référence de structure connue. Kes1p serait un convoyeur cytoplasmique de stérol participant à la création d’un gradient de stérol chez la levure. Kes1P assure probablement une ligne unique de transport. Laquelle ? Nous pensons que la structure de Kes1p encode une capacité à garantir un transport unidirectionnel d’ergostérol du RE au trans-Golgi. Tout d’abord, Kes1p a une sensibilité à la courbure membranaire adéquate pour cibler le RE fortement tubulé et extraire du stérol de son lieu de synthèse. Une fois extrait, le stérol est bloqué dans Kes1p par un couvercle moléculaire. Nous mesurons que Kes1p délivre du stérol au contact du PI(4)P. Ce lipide singulier marque le trans-Golgi : il forcerai donc Kes1p à délivrer du stérol à cet organelle. Un couvercle contrôlé par le PI(4)P serait avantageux pour interdire le retour du stérol au RE, donc pour assurer un transport vectoriel. En d’autres mots, nous avons avec Kes1p un modèle remarquable pour étudier comment une protéine est structurellement adaptée pour assurer un transport unidirectionnel. Deuxièmement, nous aurons aussi la possibilité de reproduire un transport vectoriel avec des compositions membranaires les plus réalistes. Notamment, nous regarderons si des lipides clés, les sphingolipides, en séquestrant du stérol dans des liposomes géant mimant le trans-Golgi, aide Kes1p à assurer un routage unidirectionnel.
En parallèle, nous voulons démontrer avec ORP9L et OSBP l’interdépendance d’une capacité à connecter des membranes avec celle de lier ou transporter du stérol. Dans les cellules eucaryotes, des zones de contact existent entre trans-Golgi et RE. Diverses protéines transfèrent via cet espace étroit entre membrane des lipides et ajustent la composition lipidique du trans-Golgi. Dans ce contexte, l’architecture d’OSBP et d’ORP9L est fascinante. Avec un domaine de liaison au stérol comme Kes1p, elles ont deux domaines additionnels, un pour résider sur le trans-Golgi, l’autre pour lier le RE. Si des études cellulaires donnent des indications précieuses sur OSBP, elles ne révèlent ni son mode d’action, ni même sa fonction réelle. Une hypothèse est qu’OSBP ponte la membrane du Golgi avec celle du RE en réponse à un stérol de signalisation. Nous voulons le démontrer. Ceci indiquera si OSBP aide à positionner d’autres transporteurs de lipide pouvant eux-aussi s’associer au deux compartiments. A l’opposé, ORP9L serait un vrai transporteur. Nous étudierons si ORP9L, doit connecter en permanence deux membranes pour assurer un transport efficace et vectoriel de stérol. L’attachement membranaire est-il avantageux pour un transport de lipides ? En corrélant in vitro une activité d’attachement membranaire à une capacité de liaison au stérol, nous espérons répondre à ces questions clefs qui sont apparues récemment sur ces protéines.
Enfin, les protéines OSH/ORP semblent coupler divers processus cellulaires à l’homéostasie du stérol. Ce sont d’évidentes cibles pharmacologiques. Par modélisation moléculaire avec l’aide de nos outils expérimentaux et de notre travail autour de la structure de Kes1p, nous souhaitons proposer des molécules interférant avec les protéines OSH/ORP.