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JCJC : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes : Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (JCJC SVSE 5)
Edition 2010


DenSicelles


Micelles complexes polyioniques : vecteurs de siRNA dans les cellules dendritiques immatures pour une immunothérapie cellulaire ex vivo dans l'arthrite.

Développement d'un vecteur, outil thérapeutique en immunothérapie ex vivo pour l’arthrite
Notre étude consiste à développer un vecteur capable de libérer des petits ARNs interférents sur leur site d'action pour renforcer le potentiel tolérogène des cellules dendritiques. Ces cellules modifiées permettront de rétablir un contrôle de la réponse immune dans les pathologies auto-immunes comme l'arthrite.

Développement d'un vecteur de siRNA pour modifier les cellules dendritiques tolérogènes
Les cellules dendritiques (DCs), cellules présentatrices d’antigènes professionnelles, ont un rôle clé dans la réponse immunitaire adaptative. Elles sont impliquées dans les mécanismes de tolérance périphérique et capables d’orienter la réponse immunitaire vers une immunité ou une tolérance en fonction de leur état de maturation. Afin d’envisager l’utilisation de DCs immatures pour rétablir une tolérance aux antigènes du soi dans les maladies auto-immunes telle que l'arthrite, il est primordial de potentialiser leur propriétés tolérogènes. L'approche expérimentale choisie est de développer des nanoparticules capables de vectoriser de petits ARNs interférents (siRNAs), ciblant des gènes conférant des propriétés immunogènes aux DCs. La vectorisation de ces siRNAs est un domaine de recherche en pleine expansion, et l’émergence de nouveaux vecteurs synthétiques semble une alternative à l’utilisation de vecteurs viraux, souvent efficaces mais toxiques et provoquant une maturation des DCs.
Nous proposons dans ce projet, d’utiliser des micelles complexes polyioniques (PIC micelles) pour délivrer les siRNAs dans les DCs dans une stratégie thérapeutique ex vivo. Les PIC micelles sont des nanoparticules composées d'un copolymère double hydrophile ionique et d'un polymère contre-polyion qui s’auto-assemblent par interactions électrostatiques. Pour une efficacité optimale, les micelles doivent répondre à un certain nombre de critères : être stables en conditions physiologiques, être non immunogènes et préserver le phénotype immature des DCs, être endocytées et déstabiliser les membranes endosomales afin de libérer le siRNA dans le cytosol.

Formulation galénique et évaluation biologique in vitro
La formulation des micelles repose sur le choix pertinent des polymères, qui vont conférer aux micelles une taille adaptée, des propriétés d'échappement endosomal et de pH-sensibilité et permettre le chargement d'une quantité suffisante de siRNA. Des polymères de nature et de masses molaires différentes sont testés, les micelles résultantes sont caractérisées en physico-chimie et leur capacité de déstabilisation membranaire pour un potentiel échappement endosomal est évaluée sur des membranes modèles de liposomes ou de globules rouges.
L'endocytose de micelles fluorescentes et leur trafic intracellulaire sont étudiés par microscopie confocale et cytométrie de flux. Un blocage chimique spécifique de chaque voie d’endocytose est réalisé également pour identifier la voie d'entrée cellulaire préférentielle. Des cellules dendritiques primaires et des lignées sont étudiées, après mise en contact avec les micelles, leur phénotype immature et leur profil cytokinique sont vérifiés par cytométrie de flux et dosages immunologiques.
L’efficacité du complexe micelle/SiRNA est mise en évidence par la diminution d'expression d'une molécule immunogène dans des cellules dendritiques : la molécule de co-stimulation CD86, importante dans la médiation des cellules T. Un vecteur synthétique commercial, la Lipofectamine? est utilisé comme vecteur de référence.

Résultats

Des micelles chargées en siRNA répondant aux critères du cahier des charges ont été formulées avec différents copolymères et polymères. Les micelles optimales sont composées de copolymère de faible masse molaire PMAA2100-POE5000 et d'un polymère cationique de type poly-L-lysine (PLL) ou polyéthylèneimine ramifié (PEI-Y). Elles présentent des tailles inférieures à 200 nm et des rendements d'encapsulation de 83%, elles se désassemblent à pH 5. Leur absence de toxicité et d'effet de maturation a été mise en évidence sur des cellules dendritiques primaires et la capacité d'échappement endosomal des micelles PLL a été démontrée sur différents modèles in vitro.
Les micelles chargées en siRNA sont efficacement endocytées par les cellules dendritiques immatures par un mécanisme d'entrée actif et s'accumulent dans le cytosol (42% après 4h). La Lipofectamine?, vecteur de référence, présente une efficacité d'entrée cellulaire meilleure (72%) mais contrairement aux micelles, elle ne permet pas l'accumulation du siRNA à 48h. Etonnamment le taux de diminution d'expression de la molécule cible CD86 est significativement supérieure avec les micelles, comparé à la Lipofectamine? (22% contre 18%). Ainsi les micelles, malgré leur capacité d'entrée cellulaire moins performante que la Lipofectamine? présentent une capacité de transfection notable pour ce type cellulaire, tout en respectant leur état immature.
Ces résultats soulignent le potentiel de ces micelles comme vecteurs de choix pour potentialiser les propriétés tolérogènes des cellules dendritiques.

Perspectives

La transfection des cellules dendritiques est difficile et les micelles sont les premiers vecteurs développés pour ce type cellulaire. Si la première génération de micelles à base de PLL est prometteuse, il reste à évaluer la capacité de transfection de la seconde à base de PEI. D'autres cibles cellulaires pour restaurer les propriétés tolérogènes des cellules dendritiques seront intéressantes également à étudier notamment CD80, IL12, RelB.
Pour élargir les stratégies thérapeutiques, il est important d'évaluer l'administration in vivo des micelles, de mettre en évidence leur biodistribution, de déterminer la population cellulaire ciblée de façon non spécifique et le cas échéant de travailler sur le greffage de ligands à la surface des micelles pour permettre un ciblage actif (DEC 205).

Productions scientifiques et brevets

Article 1. Mise en évidence de la capacité des micelles à encapsuler une biomolécule et à la conduire sur son site d'action sans modifier la physiologie des cellules dendritiques. «Development of tripartite polyion micelles for efficient peptide delivery into dendritic cells without altering their plasticity.« J. Control. Release, 154(2) (2011) 156-63.
Article 2. Démonstration de la versatilité des micelles en fonction de leur composition. «Polymeric micelles based on polymethacrylic acid copolymers with different membrane destabilizing properties for cellular drug delivery.« Int. J. Pharm. 454(2) (2013) 611-20.
Article 3. Validation des micelles comme vecteurs de siRNA in vitro sur des cellules dendritiques primaires. «Versatile polyion complex micelles for peptides and siRNA vectorization to engineer tolerogenic dendritic cells.« Eur. J. Pharm. Biopharm. soumis (2014).

Partenaires

ICGM UMR5253 MACS CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE LANGUEDOC-ROUSSILLON

Aide de l'ANR 215 000 euros
Début et durée du projet scientifique - 36 mois

Résumé de soumission

Les cellules dendritiques (DCs), cellules présentatrices d’antigènes professionnelles, ont un rôle clé dans la réponse immunitaire adaptative. Elles sont impliquées dans les mécanismes de tolérance périphérique et capables d’orienter la réponse immunitaire vers une immunité ou une tolérance en fonction de leur état de maturation. Afin d’envisager l’utilisation de DCs immatures pour rétablir une tolérance aux antigènes du soi dans les maladies auto-immunes telle que la polyarthrite, il apparaît crucial de bloquer l’induction de leur maturation afin de potentialiser leur propriétés tolérogènes. Nous envisageons d’utiliser de petits ARNs interférents (siRNA), ciblant des gènes conférant des propriétés immunogènes aux DCs. La vectorisation de ces siRNAs est un domaine de recherche en pleine expansion, et l’émergence de nouveaux vecteurs synthétiques semble une alternative plus réaliste que l’utilisation de vecteurs viraux, souvent efficaces mais toxiques. Nous proposons dans ce projet, d’utiliser des micelles complexes polyioniques (PIC micelles) pour délivrer ex vivo les siRNAs dans les DCs.
Les PIC micelles sont des nanoparticules composées d'un copolymère double hydrophile ionique et d'un polymère contre-polyion qui s’auto-assemblent par interactions électrostatiques. Pour une action optimale, les micelles doivent répondre à un certain nombre de critères : être stables en conditions physiologiques, être cyto-tolérantes vis-à-vis des DCs (ne pas modifier leur statut fonctionnel), être endocytées et protéger le siRNA pour le libérer dans le cytosol après échappement endosomal. Une étude avec des PIC micelles d’acide polyméthacrylique-b-polyethylène oxyde et de poly-L-lysine nous a permis d’obtenir des objets répondant à tous ces critères. Des molécules modèles (peptide, siRNA) ont ensuite été encapsulées pour valider le concept. Les micelles en présence des DCs ont permis, pour le peptide une présentation efficace aux lymphocytes T et pour le siRNA une extinction de l’expression de la protéine cible.
Le projet est divisé en 3 objectifs. L’objectif 1 consiste en l’optimisation des PIC micelles pour permettre une libération efficace du siRNA dans le cytosol et l’étude de leur trafic intracellulaire. Des micelles seront préparées avec des copolymères à chaînes plus longues, greffés avec des fluorophores afin d’améliorer et de suivre l’échappement endosomal. Enfin, nous caractériserons leur trafic intracellulaire à l’aide d’inhibiteurs spécifiques, leur localisation subcellulaire par co-localisation avec des protéines marqueurs et étudierons le devenir des polymères une fois dans le cytosol.
L’objectif 2 consiste à tester in vitro différents siRNAs afin de diminuer l’immunogénicité des DCs et d’orienter la réponse immunitaire vers un phénotype Th2. Les molécules cibles seront les cytokines pro-inflammatoires telles que l’IL-12 et/ou des molécules de co-stimulations (CD40). Les propriétés tolérogènes des DCs seront évaluées in vitro, d’une part par la caractérisation de leur état de maturation, de leur profil cytokinique et de leur capacité à induire, ou non, une prolifération des lymphocytes T.
Enfin l’objectif 3 consiste à étudier la capacité de ces DCs immatures, transfectées par les micelles de siRNA, à moduler la réponse immune in vivo, dans un modèle expérimental d’arthrite. Ces DCs modifiées seront injectées à différentes étapes de la pathologie afin d’évaluer leur efficacité thérapeutique. Ce projet est basé sur une étroite collaboration entre des pharmaciens-chimistes développant des PIC micelles comme vecteurs de molécules thérapeutiques et des biologistes cellulaires utilisant les DCs pour induire une tolérance dans les modèles expérimentaux d’arthrite. Le résultat final sera de renforcer le potentiel thérapeutique de DCs immatures pour envisager leur utilisation dans les maladies auto-immunes telles que l’arthrite expérimentale et la polyarthrite rhumatoïde chez l’homme.

 

Programme ANR : JCJC : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes : Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques (JCJC SVSE 5) 2010

Référence projet : ANR-10-JCJC-1502

Coordinateur du projet :
Madame Anne AUBERT-POUESSEL (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE LANGUEDOC-ROUSSILLON)
aaubert@nulluniv-montp1.fr

 

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L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.