Exploration des glycosyltransférases impliquées dans la synthèse et l'assemblage des glycosaminoglycanes. Impact de la phosphorylation/sulfatation de la chaîne polysaccharidique – GAGnetwork

La biosynthèse des glycosaminoglycanes (GAGs) revêt une importance biologique considérable en raison du rôle prépondérant de ces macromolécules dans les mécanismes de régulation cellulaire et extracellulaire. En effet, grâce à leur capacité d'interaction avec les médiateurs solubles (cytokines, facteurs de croissance), les GAGs régissent de multiples processus biologiques (croissance et différenciation cellulaire, morphogenèse des tissus, réparation tissulaire). Ils sont également impliqués dans de nombreuses situations pathologiques notamment au cours du processus de carcinogenèse dans les mécanismes d'invasion tumorale et de progression métastasique. La biosynthèse des GAGs est initiée par la formation d'une séquence tétrasaccharidique d'ancrage fixée sur un squelette peptidique (GlcAß1,3Galß1,3Galß1,4Xylß-O-Ser) à partir de laquelle s'effectue la polymérisation des chaînes d'héparine (Hep) et d'héparane-sulfates (HS) ou de chondroïtine-sulfates (CS)-/dermatane-sulfates (DS). Si la séquence globale des réactions conduisant à l'édification de ces chaînes est établie, la caractérisation moléculaire des glycosyltransférases impliquées est récente. Leur contribution individuelle dans le processus d'assemblage des différentes chaînes de GAGs est encore mal définie. La question fondamentale des mécanismes permettant l'aiguillage des voies de biosynthèse vers l'un ou l'autre des types de chaînes n'est pas élucidé. Des travaux récents suggèrent que la phosphorylation et la sulfatation spécifiques de certains résidus de l'amorce pourraient jouer un rôle important dans la régulation de l'initiation et de l'orientation des voies de biosynthèse. Notre objectif est d'établir les bases moléculaires régissant les étapes majeures des voies de biosynthèse des GAGs et de déterminer l'influence de la sulfatation et de la phosphorylation sur le mécanisme d'assemblage de ces macromolécules polysaccharidiques. Dans cet objectif, notre projet vise (1) à définir la spécificité des glycosyltransférases impliquées dans les étapes d'initiation et à élucider les mécanismes régissant l'orientation des voies de biosynthèse vers les HS/Hep ou CS/DS, (2) à identifier les déterminants structuraux conditionnant la reconnaissance des substrats saccharidiques phosphorylés/sulfatés. De façon complémentaire, nous souhaitons développer une approche ex vivo des mécanismes d'assemblage des GAGs. Pour ce faire, l'influence de la surexpression des glycosyltransférases d'intérêt ou au contraire de leur extinction par des stratégies siRNA et par modification épigénétique (méthylation de l'ADN) sera évaluée par l'analyse quantitative et qualitative des GAGs néosynthétisés dans des modèles cellulaires (chondrocytes, chondrosarcomes). La réalisation de ce projet repose sur l'association de quatre partenaires : Notre groupe fortement impliqué dans les études fonctionnelles et structurales des glycosyltransférases responsables de la synthèse des glycosaminoglycanes (Partenaire 1, S. Fournel-Gigleux, UMR CNRS 7561-Université de Nancy I), une équipe spécialiste de la chimie des sucres (Partenaire 2, J.C. Jacquinet, UMR CNRS 6005-Université d'Orléans), des bio-informaticiens spécialistes de l'analyse phylogénétique des glycosyltransférases (Partenaire 3, R. Oriol, INSERM U 602), des physicochimistes fortement impliqués dans l'analyse des interactions protéine-glycosaminoglycanes (Partenaire 4, H. Lortat-Jacob UMR CNRS 5075, Institut de Biologie Biologie Structurale, Grenoble). La première partie du projet sera consacré à l'analyse fine des propriétés catalytiques des glycosyltransférases humaines recombinantes vis-à-vis de séries de molécules analogues de l'amorce glycopeptidique des GAGs. Un effort important dédié à la synthèse de ces molécules complexes permettra pour la première fois d'évaluer l'influence de la phosphorylation et de la sulfatation sur l'activité de ces enzymes. Les déterminants structuraux régissant la reconnaissance de ces substrats seront ensuite identifi